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一、背景:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,高度恶性、预后差,如不经治疗,一般于出现症状后4～6个月死亡。手术切除、化疗、放疗、介入治疗是本病的常用治疗方法,其中手术切除为首选,但是大多数患者确诊时已发展到中晚期,此时多数病人的肝功能和体质状况较差,能做肝切除手术者不到20%。常用的化疗药物目前有阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂等,但效果不够理想,因此人们目前仍在寻求高效低毒的化疗药物。雷公藤内酯醇(Triptolide,以下简称TPL)是从卫矛科雷公藤属植物雷公藤中分离到的二萜内酯化合物,分子式C20H24O6,分子量为360.4,临床上已广泛应用于自身免疫性疾病,如类风湿关节炎、肾炎、红斑狼疮等的治疗。近年来的研究发现TPL具有广泛且高效的抗肿瘤作用。通过30多年的研究发现TPL对人白血病、淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤、胃癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌和黑色素瘤等60多种肿瘤细胞均有很好的抑制作用。TPL对肝癌细胞同样具有很好的抑制作用,近年来的研究发现TPL能抑制SMMC-7721、Hepg2等肝癌细胞增殖及诱导其凋亡,但未见有关TPL对肝癌Bel-7402细胞体内外作用的报道。二、目的:本课题以肝癌细胞株Bel-7402、Hepg2及Bel-7402细胞裸鼠移植瘤为对象,研究TPL体内外抗肝癌作用,并对其机制进行初步研究,为临床应用提供理论基础。三、方法:1.采用MTT比色法、集落形成实验检测不同浓度TPL(5～80ng/ml)对Bel-7402细胞及Hepg2细胞增殖的抑制作用。2.采用AO-EB荧光染色、TdT酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法、DNA片段化检测及电镜观察细胞超微结构等方法检测不同浓度TPL(5～80ng/ml)对肝癌Bel-7402及Hepg2细胞凋亡的影响。3.采用RT-PCR技术检测经TPL (20、40、80ng/ml)作用后Bel-7402细胞bcl-2、bax、c-myc基因mRNA表达水平的改变。4.采用肿瘤生长曲线及抑瘤率评估TPL对Bel-7402细胞裸鼠异种移植瘤的作用:于裸鼠皮下接种对数生长期的Bel-7402细胞,建立肝癌Bel-7402细胞裸鼠异种移植瘤模型。待肿瘤直径达0.5cm时随机分组,每组6只,分为5组,分别为:(1)阴性对照组:给予含2%丙二醇的生理盐水;(2)阳性对照组:给予30mg/kg 5-氟尿嘧啶;(3)TPL组:分别给予100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg TPL。给药方式为尾静脉注射,隔天给药,共7次。给药期间定期测量肿瘤的长径(a)、短径(b),按公式V=ab2/2计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。并定期观察裸鼠体重的变化及进食量等。末次给药后24小时,处死裸鼠。完整剥离瘤块并称取离体瘤块重量、计算抑瘤率;透射电镜观察TPL对Bel-7402细胞裸鼠移植瘤组织细胞超微结构的影响;同时摘除眼球取血检测血常规及肝肾功能,并取心、肝、脾、肺、肾等组织作病理检查以检测TPL对裸鼠的毒性作用。四、结果:1.TPL可抑制肝癌Bel-7402细胞及Hepg2细胞增殖,且这种作用具有时间及浓度依赖性。TPL对Bel-7402细胞及Hepg2细胞作用48h的IC50分别为42.82ng/ml、7.32ng/ml。2.TPL可诱导肝癌Bel-7402细胞及Hepg2细胞凋亡。AO-EB双染法结果证实TPL可诱导肝癌Bel-7402及Hepg2细胞凋亡,透射电镜也显示TPL可诱导Bel-7402细胞凋亡。TUNEL法检测5、10、20、40、80ng/ml TPL处理48h的Bel-7402细胞及Hepg2细胞,显示两种细胞均有不同程度的凋亡细胞出现,Bel-7402细胞的凋亡率依次为9.2%、19.8%、30.2%、52.0%、64.6%,Hepg2细胞的凋亡率依次为15.0%、31.6%、49.2%、58.7%、69.1%。DNA片段化检测可见TPL处理组细胞呈现典型的梯形条带。3. TPL可调控Bel-7402细胞凋亡相关基因的表达。RT-PCR显示,分别以20、40、80ng/ml的TPL处理Bel-7402细胞48小时后,c-myc、bcl-2基因的mRNA表达下调,bax基因的mRNA表达上调,且呈浓度依赖性。4. TPL可抑制Bel-7402细胞裸鼠异种移植瘤的生长。尾静脉注射TPL 100μg/kg、200μg/kg和400μg/kg后,TPL对Bel-7402细胞裸鼠异种移植瘤的抑瘤率分别为27.2%(p>0.05)、50.0%(p<0.01)和69.5%(p<0.01),且400μg/kg组较200μg/kg组明显(p<0.05),说明TPL对Bel-7402细胞裸鼠移植瘤的作用呈浓度依赖性,且400μg/kg组效果明显优于5-FU组(p<0.01);透射电镜发现TPL处理组瘤组织中可见较多凋亡细胞;TPL治疗组与对照组比较荷瘤裸鼠的体重无明显减轻(p>0.05),血常规及肝肾功能亦未见明显异常,心、肝、脾、肺、肾等脏器未发现明显病理改变。五、结论:1. TPL可抑制体外培养的人肝癌Bel-7402及Hepg2细胞的增殖,并呈时间及浓度依赖性;2. TPL可诱导体外培养的人肝癌Bel-7402及Hepg2细胞的凋亡,并呈浓度依赖性;3. TPL诱导人肝癌Bel-7402细胞的凋亡作用,可能与上调bax基因,下调bcl-2、c-myc基因表达有关;4. TPL可抑制Bel-7402细胞裸鼠异种移植瘤的生长,呈剂量依赖性,且效果优于5-氟尿嘧啶。