论文部分内容阅读
研究背景支气管哮喘作为一种由多种炎性细胞、结构细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症,其特征是气道高反应和可逆性气流受限。其症状多为咳嗽、喘息,夜间及凌晨多发。根据目前调查,哮喘的发作影响了不同国家的1-18%的人口,而我国有4500万成年人患有哮喘;在肺部,NLRP3炎性小体通过识别病原相关分子模式(PAMP)或者宿主来源的危险信号分子模式(DAMP)招募和激活促炎症蛋白酶Caspase-1;活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体,产生相应的成熟细胞因子IL-1β和IL-18,诱导炎症发生。研究表明哮喘急性发患者中,NLRP3炎症小体显著增加,表明NLRP3炎症小体在哮喘的发病过程中扮演重要角色。研究表明,半乳糖凝集素-1具有广泛的抗炎及免疫调节作用,虽然已证明Gal-1在巨噬细胞炎症中具有广泛的抗炎作用,但具体的分子机制仍不明了,因此本研究拟用巨噬细胞构建炎症反应模型,研究外源性Gal-1对NF-κB-NLRP3信号通路的干预作用。研究目的半乳糖凝集素-1对金黄色葡萄球菌LTA诱导的巨噬细胞中NLRP3抑制作用及其机制的探讨。研究方法培养Raw264.7巨噬细胞于96孔板至稳定状态,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测不同浓度重组小鼠源半乳糖凝集素-1(rm Gal-1)对细胞活力的影响,光学显微镜观察不同浓度下细胞的状态;培养巨噬细胞与12孔板中,LTA分别刺激1h、3h、6h测Gal-1、NLRP3、p65蛋白的表达;培养巨噬细胞与12孔板中,分为药物试验四组,即空白对照组(Control组)、炎症模型组(LTA组)、药物对照组(rm Gal-1组)、干预组(LTA+rm Gal-1组),另一个阳性对照四组为:空白对照组(Control组)、炎症模型组(LTA组)、药物对照组(JSH-23组)、干预组(LTA+JSH-23组),模型组用LTA刺激小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞,药物组和阳性对照组分别用rm Gal-1和NF-κB抑制剂JSH-23预处理Raw264.7细胞。激光共聚焦显微镜观察细胞内P-p65及NLRP3的表达;Western blot法进一步检测细胞中p65、P-p65、NLRP3、ASC、Caspase-1和Pro-Caspase-1的蛋白表达水平。研究结果光镜下观察,鼠源性重组半乳糖凝集素-1(0.04、0.4)μg/ml干预后,细胞状态基本不变,当药物浓度增加到4μg/ml时,细胞受到显著抑制,受刺激过度,生出触角。MTT实验进一步证明,与对照组(0μg/ml)相比,rm Gal-1浓度在0.04μg/ml及0.4μg/ml对细胞活力无明显影响,而在4μg/ml时显著影响细胞活力(P<0.01)。LTA刺激Raw246.7巨噬细胞活化NF-κB-NLRP3通路呈时间依赖性,且P-p65、NLRP3及Gal-1的表达水平在刺激3 h后达到高峰,随时间延长,内源性Gal-1的表达水平显著增高(P<0.05)。免疫荧光结果显示,LTA刺激Raw264.7细胞3 h后,细胞质内绿色荧光NLRP3及P-p65表达水平较对照组明显增强,同时,Western blot检测结果也表明,LTA组细胞内NLRP3、P-p65、ASC、Caspase-1表达水平显著升高(P<0.01),分别用rm Gal-1和NF-κB抑制剂JSH-23共处理后结果一致,细胞内NLRP3、P-p65、ASC、Caspase-1表达水平显著降低(P<0.01)。研究结论Gal-1可能通过NF-κB-NLRP3信号通路抑制LTA诱导的巨噬细胞炎症。