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在心脏疾病晚期心脏移植常作为主要的治疗手段,减轻心脏低温保存导致的心肌损伤是保证和提高整个手术成功的关键。利格列汀是一种选择性极强的二肽基肽酶4(dipeptidylpeptidase4,DPP-4)抑制剂。早期研究发现,利格列汀可以抑制DPP-4、减少胰高血糖素样肽-1和抑胃肽的分解代谢,从而降低血糖浓度,由于DPP-4抑制剂改善高血糖状况,保护胰岛β细胞的作用显著,因此最初作为一种新型降糖药被广泛运用于临床。近年来的研究表明,DPP-4抑制剂在心血管保护方面也具有重要作用。研究发现,DPP-4抑制剂具有抗氧化应激的功能,通过降低慢性心肌梗死大鼠心肌的氧化应激水平,改善心率变异性和左心室功能。DPP-4抑制剂还可通过减少巨噬细胞浸润、降低炎性因子CD11b和CD11c的水平,从而达到心血管保护作用。故我们推测在Celsior液心脏低温保存液中添加利格列汀,具有减轻低温保存导致的心脏功能下降的作用。目的本实验主要在离体大鼠心脏低温保存模型上观察利格列汀是否可以促进低温保存心脏在复灌期心功能的恢复,并探讨其可能的机制方法1)建立心脏Langendorff灌流模型。SD大鼠离体心脏固定于Langendorff装置上,从主动脉根部逆行恒压灌注(76mmHg)。灌流液选用37℃氧合的Krebs-Henseleit 液体(KH 液)。2)建立心脏低温保存模型:大鼠心脏在Celsior液中4℃低温保存9h后,固定在Langendorff装置上,用KH液再灌注60 min。3)心功能的测定:通过MedLab生物信号采集处理系统记录心功能指标,包括:左心室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左心室发展压力(left ventricular developed pressure,LVDP)、心室最大收缩速率(Maximal systolic velocity of left ventricular pressure,+dP/dtmax)、心室最大舒张速率(Maximal diastolic velocity of left ventricular pressure,-dP/dtmax)、心率、(heart rate,HR)等。4)Western blotting法检测蛋白:提取心肌组织总蛋白和线粒体蛋白,Western blotting 法检测心脏组织中 Drp1、Drp1 S616、CaMK Ⅱ、p-CaMK Ⅱ、RhoA、mitofusin 1(Mfn 1)、mitofusin2(Mfn2)等蛋白的表达水平。5)心肌活性氧生成的测定:参照活性氧检测试剂盒的说明书,用DCFH-DA法测定心肌活性氧生成。6)心肌脂质氧化的测定:利用脂质氧化的产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)可与硫代巴比妥酸反应产生红色产物的显色反应的原理。参照脂质氧化检测试剂盒说明书测定组织脂质氧化水平。7)心肌MnSOD活性检测:参照MnSOD活性检测试剂盒,用WST-8法测定组织中MnSOD活性。8)透射电镜观察大鼠心肌线粒体形态。结果1)SD大鼠离体心脏在低温保存9 h后,再灌注60 min时,LVEDP明显升高,LVDP、+dP/dtmax和-dP/dtmax均明显下降。与低温保存组相比,加入不同浓度的利格列汀后,发现中、高浓度的利格列汀(0.50、0.75nM)组能明显抑制低温保存所致的LVEDP的抬高,以及LVDP、+dP/dtmax和-dP/dtmax的降低,低、中、高浓度利格列汀组均能增加低温保存心脏复灌后冠脉流量。2)与空白对照组相比,大鼠离体心脏低温保存后再灌注60 min时,心室肌组织NOX2的表达明显增高。中、高浓度利格列汀(0.5、0.75 nM)组能明显抑制低温保存后NOX2的高表达。与低温保存液组比,各个浓度利格列汀均能减少低温保存心脏ROS的产生,同时中、高浓度利格列汀还能抑制低温保存诱导的丙二醛水平增高。3)与空白对照组相比,大鼠离体心脏低温保存后心肌组织总Drp1水平无显著变化,但p-Drp1S616和线粒体Drp1蛋白水平却明显增加。同时空白对照组和单纯低温保存组相比,线粒体Mfn1、Mfn2和Opa1的表达水平无统计学差异。4)与空白对照组相比,大鼠离体心脏低温保存后CaMKⅡ和RhoA蛋白表达量无明显变化;但p-CaMKⅡ的表达却明显增高。5)心脏低温保存后p-CaMKⅡ和p-Drp1S616水平明显升高,而高浓度利格列汀与NOX2的特异性抑制剂Phox-I2能显著降低低温保存诱导的p-CaMK Ⅱ,p-Drp1 S616和线粒体Drp1表达增加。同时,CaMK Ⅱ特异性抑制剂KN-93也能显著对抗低温保存诱导的p-Drp1 S616和线粒体Drp1表达量的增加。6)单纯低温保存后大鼠心肌肌丝紊乱程度增加,出现空泡,线粒体片段化程度增加。利格列汀组能显著降低低温保存引起的线粒体片段化。结论本实验结果表明利格列汀可以促进大鼠心脏低温保存后心功能的恢复。其作用机制可能与抑制NOX2的过度表达,降低Drp1 S616磷酸化和线粒体转位,减少线粒体分裂有关。