实验背景:已知酪氨酸激酶受体RON的异常表达可以通过改变多种细胞功能导致恶性肿瘤的进展和转移。其中在基因水平上发生剪接变异是其蛋白表达异常的机制之一。本次实验我们在结肠癌细胞系HT29细胞中发现了一种新的RON剪接变异体:RONA165E2。该变异体在基因水平上缺乏编码外显子2的mRNA,其对应β链上的63个氨基酸缺失,从而产生了一个大小为165kda的单链蛋白。进一步实验发现蛋白RON△165E2表达于细胞内,与巨噬细胞刺激蛋白MSP无相互作用,并且该变异体无内在酪氨酸激酶活性。实验目的与方法:通过构建野生型及新型变异体RON质粒载体并转染人胚肾上皮细胞建立蛋白表达体系;通过免疫沉淀、免疫印迹、细胞功能实验、动物实验等了解变异体RON△165E2蛋白的生物学特性,并为下一步研究结直肠癌靶向治疗失败患者耐药机制提供重要的工具。实验结果:在表达变异体RON的人胚肾上皮细胞中,我们发现与表达野生型蛋白的上皮细胞相比,细胞内PI3K/Akt/mTOR通路存在过度激活,同时PTEN的磷酸化水平也明显升高。另外,在多种体内体外实验中我们发现RON△165E2促进了上皮细胞的迁移、肿瘤的生长。最后,在收集的67例确诊CRC临床标本中,我们发现RON缺失外显子2的变异体发生率约达58%,并与结直肠癌的局部浸润深度存在正相关性。根据以上这些结果我们推测:新的缺失外显子2的RON剪接变异体可能通过PTEN的磷酸化抑制其活性,从而激活上皮细胞中PI3K/Akt/mTOR通路,促进了肿瘤细胞的浸润、生长。