美花石斛香气成分及合成基因鉴定

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美花石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物。花香作为美花石斛重要的观赏性状之一,但花香的挥发性成分及其生物合成过程都十分复杂,且花香处于动态变化的过程,使得美花石斛药用活性成分、花型、花色方面的研究较花香更深入。因此,研究美花石斛花香代谢物及花香生物合成相关基因是很有必要的。本研究以贵州兴义的浓香型美花石斛和广东罗浮山的淡香型美花石斛盛开期花朵为材料,进行非靶向代谢组学分析,筛选差异代谢物与代谢途径;进行转录组测序,初步筛选与美花石斛花香生物合成相关差异表达基因,并进行表达量验证;进行代谢组和转录组联合分析,对联合分析所得差异基因以浓香型美花石斛的花蕾期、半开期、盛开期及衰败期4个时期的花朵为材料进行表达量分析。有助于探究美花石斛香气主要成分及生物合成的分子机制,为选育芳香型石斛兰新品种做初步准备。1.本研究从2种香型美花石斛盛开期花的挥发性成分中定性出80种化合物,共分为11个类别。醛类(15)、萜类(14)、烷烃类(11)代谢物的数量较多,萜类、醛类、酯类的相对含量较高分别23.54%、18.03%、17.71%;经PCA分析与OPLS-DA分析,可知2种香型美花石斛代谢物明显分离,并筛选出38种差异显著的代谢物;浓香型的差异代谢物以萜类(21.85%)、酯类(16.69%)和醇类(8.68%)为主,淡香型的差异代谢物以杂环化合物(6.84%)、萜类(6.43%)和醛类(6.06%)为主;差异最大的代谢物为香叶醇与4-丙基-苯酚,Log2差异倍数分别为21.58和-17.29。2.美花石斛花转录组共有271 241 852 Raw reads,经筛选得到257 937 448Clean reads,转录组的Q20碱基百分比均大于97%,Q30碱基百分比均不小于92.95%,整体测序错误率为0.03%,GC含量均分布在45.1%~46.1%;获得unigene175 089条,平均长度为1 168 bp,其N50为1 745 bp,N90为371 bp,总长度为204 522 529 bp,长度集中在200~2 000 bp,其中长度在200~1 000 bp范围的序列最多(100 264条);69.16%(121 096条)的unigene在数据库中得到注释,NR数据库注释到的unigene数量最多(120 597条,68.88%);unigene主要注释到铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰、深圳拟兰3个物种。3.以美花石斛茎、叶与花的c DNA为模板,对TUA、TUB、EF-1α-1、EF-1α-2、UBI、NADPH这6个候选内参基因进行表达稳定性分析,Ge Norm软件分析结果为NADPH=UBI>TUB>EF-1α-2>EF-1α-1>TUA,Norm Finder软件的分析结果为UBI>NADPH>EF-1α-2>EF-1α-1>TUB>TUA。综合分析ge Norm和Norm Finder软件的结果,最终选择UBI作为美花石斛的内参基因。4.初步筛选得到17个与美花石斛花香合成相关的结构基因,并进行表达量验证,结果表明基因表达量变化趋势与FPKM基本一致。以淡香型美花石斛作为比较,ECHS、UGT2、GGPPS、TKPR、UQCRFS、PER、MTDH、SDR、MFP-α、KAT在浓香型美花石斛花中表达量上调,FACE、PAL、C4H、CAD、UGT1、AOC、LOX在浓香型美花石斛花中表达量下调。5.代谢组与转录组联合分析,发现CAD、PAL、C4H与丁子香酚相关性较强,LOX与(Z)-3-己烯醛相关性较强。在浓香型美花石斛4个开花阶段对基因进行表达量分析可知,CAD在盛开期的表达量最高,衰败期表达量最低;PAL盛开期表达量最低,其余3个开花时期表达量较高且表达水平接近;C4H花蕾期表达量最高,盛开期表达量最低;LOX花蕾期表达量最高,盛开期最低。
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