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[研究背景及目的]病毒性肝炎以肝细胞损伤为主要特征,然而肝细胞损伤的具体机制尚未完全明确。目前大部分学者认为肝炎病毒本身并不直接造成肝细胞的损伤,而机体抗肝炎病毒的免疫反应,特别是免疫细胞介导的免疫反应,是造成肝细胞损伤的主要原因。多种免疫细胞亚群,如CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、调节性T细胞、巨噬细胞等,都被证实在这一病理过程中发挥重要作用。近年来随着对肝炎发病机制研究的深入,越来越多的研究表明非特异性免疫反应,特别是NK细胞和巨噬细胞介导的非特异性免疫反应,也参与了病毒性肝炎感染引起肝脏损伤的发病机理。我们对HBV诱导的暴发型肝衰竭(FHF)和慢加急性肝衰竭(HBV-induced acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)研究后发现,肝脏NK细胞通过死亡受体途径Fas/FasL和NK细胞受体配体识别途径NKG2D/NKG2DL对肝细胞造成损伤。在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠暴发性肝衰竭中活化的巨噬细胞能够分泌炎性因子TNF, IL-1进一步促进肝脏中的炎症反应并加重肝细胞损伤。此外,活化的巨噬细胞还分泌促凝血活性物质fgl2凝血酶原酶(fibrinogen like protein 2),fgl2凝血酶原酶可以激活凝血级联反应,引起肝脏微循环障碍并导致肝细胞大块死亡。因此明确各种免疫细胞及其分泌的细胞因子形成的免疫网络在病毒性肝炎引起肝细胞损伤中的作用将有助于更加全面的认识病毒性肝炎的发病机制,并为其临床诊断和治疗提供重要的靶点。近年研究发现,机体存在一种新型T细胞亚群——CD3+CD4-CD8细胞(双阴性T细胞,DN T)。在健康人群和正常小鼠外周血T细胞中,DNT细胞所占比例为1-5%。随着对DN T细胞的深入研究,越来越多的证据表明DNT细胞在多种疾病,如移植排斥、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、感染性疾病、过敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病的病理进程中发挥重要作用。在不同的疾病中DN T细胞表达不同的表面标志细胞,分泌独特的效应因子,通过这些效应因子发挥其生物学功能。在器官移植模型中,将脾细胞来源的DN T细胞克隆后输入小鼠体内,DN T细胞能够通过Fas/Fasl、穿孔素等途径杀伤抗供者CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞,从而提高移植物的存活时间和存活率。Zhang, Z等通过对MRL/lpr小鼠模型中DNT细胞研究后发现,系统性红斑狼疮模型鼠(MRL/lpr)中DNT细胞高表达IL-17和IL-23R,并且与疾病进程及严重程度呈正相关。在感染土拉热弗郎西丝菌(Francisella tularensis)的小鼠中,研究发现感染后肺组织中DN T细胞可以分化为两个亚群,一群主要分泌IL-17,而另一群以分泌IFN-γ为主,并在疾病进程中发挥不同的生物学作用。Lis R. V等研究发现利什曼原虫感染者外周血TCRαβ+DNT (TCRαβ+CD4-CD8-)细胞可以分泌炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α,而TCRγδ+DNT(TCRγδ+CD4-CD8-)主要分泌调节性细胞因子IL-10。迄今,肝脏DN T细胞是否在病毒性肝炎中发挥作用尚不明确。本实验室以鼠3型肝炎病毒(MHV-3,murine hepatitis virus 3)感染C3H/Hej小鼠成功建立了小鼠病毒性肝炎模型,本研究拟利用MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型,探讨DN T细胞在病毒性肝炎发生发展中的作用。具体研究目标如下：1.研究在病毒性肝炎模型小鼠肝脏中DNT细胞TCRγδ+DN T细胞亚群和TCRαβ+DN T细胞亚群的比例。在疾病进程中动态观察病毒性肝炎模型小鼠肝脏TCRγδ+DN T细胞比例、数量。2.鉴定肝脏TCRγδ+DN T细胞的表面标志和细胞因子谱。3.探讨肝脏TCRγδ+DN T细胞细胞对肝细胞的损伤作用及机制。[研究方法]1.MHV-3腹腔感染途径建立小鼠病毒性肝炎模型。流式细胞术检测正常和感染MHV-310天后模型小鼠肝脏DNT表达TCRγδ+和TCRapαβ+的比例。动态观察MHV-3感染0、3、7、10、15、20、30天后模型小鼠肝脏TCRγδ+DN T细胞在肝脏T细胞中比例变化及其绝对计数。2.流式细胞术检测感染MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝脏TCRγδ+DN T细胞表达表面标志CD30、CD25、CD28和CD44的百分率、感染MHV-3后各时间点肝脏TCRγδ+DN T细胞表达活化标志CD69分子的百分率。采用细胞因子染色法检测肝脏TCRγδ+DN T细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21、IL-22、肿瘤坏死因子-α(TNF-a,tumor necrosis factor-α)、γ-干扰素(interferon, IFN-γ)、穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)的水平。采用a-GalCer:mCDld二聚体来鉴定肝脏TCRγδ+DN T细胞与NKT细胞之间的关系。3.体外实验：磁珠分选肝脏TCRγδ+DN T细胞。胶原酶原位灌流消化法分离小鼠原代肝细胞。以感染MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝脏TCRγδ+DN T细胞为效应细胞,肝细胞为靶细胞,采用非放射性细胞毒实验检测肝脏TCRγδ+DN T细胞在体外对正常或感染MHV-3的原代肝细胞的杀伤活性。采用Transwell法检测肝脏TCRγδ+DNT细胞对肝脏细胞的杀伤作用是否依赖细胞与细胞间的接触。在体外,通过抗体阻断TNF-α, IFN-γ和IL-17A检测肝脏TCRγδ+DN T细胞杀伤肝细胞的作用途径。4.体内实验：将磁珠分选纯化的肝脏TCRγδ+DN T细胞经尾静脉被动转移过继到MHV-3感染5天后C3H/Hej小鼠体内(3×106/只),同体积PBS液尾静脉转移过继到MHV-3感染5天后C3H/Hej小鼠体内作为对照,观察两组生存曲线、转移过继3天后各组外周血AST和ALT水平、肝脏组织H-E染色。[结果]1.在正常小鼠和MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型中,肝脏DN T细胞以TCRγδ+DNT细胞亚群为主。在感染MHV-3后各时间点肝脏TCRγδ+DN T在肝脏T淋巴细胞中的比例较感染前显著升高,在感染后10天达到最高值(19.7±3.22%)；肝脏TCRγδ+DN T细胞数量在MHV-3感染后显著增加,在感染后10天达到最高峰(6.51±1.29×105)。2.流式细胞术检测MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型中肝脏TCRγδ+DN T细胞的表面标志为TCRγδ+CD3+CD4-CD8-CD25-CD28-CD30-CD44+。肝脏TCRγδ+DNT细胞不能特异性识别α-半乳糖酰基鞘氨醇,表明这群细胞不属于NKT细胞亚群。在感染MHV-3后,随着病程进展,肝脏TCRγδ+DNT表面活化标志CD69分子表达水平持续升高,在感染后10天达到最高水平(83.45±5.32%)。模型中肝脏TCRγδ+DN T表达TNF-α、INF-γ、IL-17A和IL-2,几乎不表达IL-4、IL-10、IL-21、IL-22、FasL、穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)。3.体外实验：MHV-3诱导的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝脏TCRγδ+DN T细胞对染后肝细胞有明显的杀伤作用。通过Transwell实验发现,肝脏TCRγδ+DN T细胞对感染后肝细胞的直接杀伤作用不需要细胞与细胞间的接触。通过抗体阻断试验证明,阻断TNF-a后肝脏TCRy8+DN T细胞对感染后肝细胞的杀伤作用显著降低,而单独阻断IFN-y或IL-17A后肝脏TCRγδ+DNT细胞对感染后肝细胞的杀伤作用无显著改变。4.体内实验：将感染MHV-310天后小鼠病毒性肝炎模型中肝脏TCRγδ+DNT细胞过继给感染MHV-35天后小鼠病毒性肝炎模型小鼠,小鼠生存率显著降低,从41.7%下降至8.33%。在过继3天后,肝脏TCRγδ+DN T细胞转移过继组小鼠血清ALT和AST水平较PBS过继对照组显著升高；在过继3天后,肝脏TCRγδ+DN T细胞转移过继组肝脏病理损伤较PBS过继对照组更加明显,出现肝细胞水肿、气球样变、点状坏死、灶状坏死,甚至碎片状坏死,并伴有大量淋巴细胞浸润。[结论]1.本研究首次利用MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型探讨了肝脏TCRγδ+DN T细胞在病毒性肝炎中的作用。研究发现小鼠病毒性肝炎模型中肝脏TCRγδ+DNT细胞具有独特的表面标志。这群细胞不属于NKT细胞亚群。在感染MHV-3后,肝脏TCRγδ+DNT细胞的数最大最增加并且大量活化,表达细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-2。2.MHV-3诱导的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝脏TCRγδ+DNT细胞对感染后肝细胞有显著的杀伤作用。这种杀伤作用不依赖细胞和细胞间的接触。通过抗体阻断实验证明肝脏TCRγδ+DNT细胞主要是通过TNF-a对感染肝细胞发挥细胞毒作用。3.将肝脏TCRγδ+DNT细胞转移过继到病毒性肝炎小鼠体内后能够加重病毒性肝炎小鼠病情发展,导致小鼠生存率降低。4.本研究证明在小鼠病毒性肝炎模型肝脏中存在一群TCRγδ+DNT细胞,参与了小鼠病毒性肝炎的发生发展,与肝脏损伤密切相关。这一研究发现有助于深入理解病毒性肝炎的发病机制并且可能为临床诊断和治疗提供一些新的参考。