四株肉制品腐败菌的ERIC-PCR方法建立及其应用研究

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食品是人们日常生活中不可或缺的物质品之一,它维持着人们的生命和健康,但由于近几年不断爆发的食品安全问题,使人们对于食品质量及安全问题有了更多关注。目前,国内检测食品中腐败菌主要采用传统的检测方法,操作繁琐,检测时间长,且灵敏度低,此方法不能及时反映生产过程或销售过程中的污染情况。  本文从变质食品中分离得到四种腐败菌,围绕该菌种建立起一整套ERIC-PCR扩增体系,同时对菌种进行抑菌实验研究。采用六种不同的DNA提取方法实验,得出RNase酶解法作为高效提取腐败菌DNA的首选方法。通过对TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、退火温度等进行ERIC-PCR条件优化,分别建立起适宜的ERIC-PCR反应体系和扩增程序:1#菌TaqE buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶1.1μL;dNTP2μL、上下游引物各1μL、DNA模板2μL、双蒸水补齐;2#菌 TaqE buffer2.5μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、dNTP2μL、上下游引物各1μL、DNA模板2μL、双蒸水补齐;3#菌TaqDNA聚合酶 buffer2.5μL、Taq E0.3μL、dNTP2.2μL、上下游引物各0.8μL、DNA模板1μL、双蒸水补齐;4#菌 TaqDNA聚合酶 buffer2.5μL、Taq E0.9μL、dNTP1.6μL、上下游引物各1μL、DNA模板2μL、双蒸水补齐。扩增程序:1#菌94℃变性3min,94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸4min;2#菌94℃变性4min,94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸4min;3#菌95℃变性4min,94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸4min;4#菌94℃变性3min,94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸4min。将扩增产物回收测序,登录NCBI将测序结果进行网上blast,从而证实ERIC-PCR扩增产物却为目的扩增产物。  该方法对食源性腐败菌单菌检测灵敏度可达101cfu/mL-102cfu/mL,检测人工污染肉制品的混合体系中,1#菌种混合体系最低检出限分别为101cfu/mL,2#菌种混合体系为103cfu/mL,3#菌种混合体系为101cfu/mL,4#菌种混合体系为101cfu/mL,将四种菌混合后,均能够准确检测出结果,为快速检出污染肉制品中腐败菌构建了技术平台。  利用计数和吸光光度法,比较五种防腐剂的抑菌功效,综合经济成本及安全健康考虑,得出E2、E3对菌种有良好的抑菌作用。
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