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番茄的野生种含有很多抗病性相关的基因,在番茄的育种中广泛应用。其中,Lycopersicon.pennellii是一种生长在炎热干旱环境下的绿果番茄,对多种病虫害表现抗性。1994年,Y.Eshed和D.Zamir以野生番茄L.pennellii为供体亲本,栽培番茄Lycopersiconesculentum.cv.M82为受体亲本,利用了1030多个RFLP分子标记,建立了完整的野生番茄L.pennellii的渐渗系。
本研究利用L.pennellii(LA716)渐渗系中与番茄笫Ⅺ号染色体相关的四个株系IL11-1,2,3,4,分别和栽培番茄M82杂交获得其F2代分离群体,采用分子标记和基因共线性关系的方法,筛选出四个F2代群体中的共482株重组单株,利用拟南芥已知的COSⅡ标记定位番茄第Ⅺ号染色体上的IL11-3区段分子标记,获得了番茄第Ⅺ号染色体IL11-3区段精细标记的遗传图谱,并且在41个标记中找到并克隆了三个与番茄抗病性相关的基因。结果如下:
1、以野生番茄L.pennellii的渐渗系IL11-3株系为母本、M82为父本建立的F2代中,随机挑选出480个单株,利用定位各渐渗系染色体片段两端的分子标记COSIIMarkerC2_At2g14260、Hba78A16T7,筛选出发生交换的重组单株80个,计算出遗传距离。并且用已知的番茄IL11-3上的18个CAPS分子标记,在80个F2代重组单株中,进行PCR及酶切验证,建立了野生番茄L.pennellii的渐渗系IL11-3的分子标记的精细遗传图谱。这18个CAPS分子标记分别是C2_At4g10050、C2_At5g04590、TG400、C2_At3g44880、C2_At4g01560、C2_At3g44890、C2_At2g27730、C2_At3g52730、C2_At2g27290、C2_Atlg30825、C2_AGg54470、C2_At5g20890、cLEC-24-C3、C2_At5g60600、C2_At4g32930、T0302、BAC_119J05、C2_At5g25760。加上两端标记的这20个标记被定位在11.1cM之内,由此建立了渐渗系IL11-3区段精细标记的遗传图谱,该遗传图谱与康奈尔大学茄科作物网站www.sgn.cornell.edu公布的遗传距离不同。
2、分析番茄第Ⅺ号染色体上的41个CAPS标记,经过同源序列在GeneBank和EST库的比对,找到了7个与抗病相关的序列,克隆了三个与番茄抗病性相关的基因。
1)标记COSIIMarkerC2_At2g27450有与已知的公布序列AC217004、野生草莓(Fragariavesca)中一个抗盐抗热的cDNA序列(EX682439)以及番茄p-丙氨酸合成酶基因(Y19104)相同的QDXGL-GANXV氨基酸保守序列;克隆的这段基因序列长度为568bp,该序列与公布序列AC217004有98%的同源性,与野生草莓(Fvesca)中一个抗盐抗热的cDNA序列(EX682439)以及番茄β-丙氨酸合成酶基因(Y19104)有46%的同源性。标记COSIIMarkerC2_At2g27450的克隆序列及其AC217004均含有198bp的插入片段。
2)标记COSⅡMarkerC2_At3g44880的扩增序列与番茄Solanum.lycopersicum叶片坏死斑点相关的一个基因(AF321984)共有序列之间有99%的同源性。该扩增片断的基因全长为1800bp,其中352bp为扩增序列,但是,包含有94bp与AF321984不同的插入序列。
3)标记COSⅡMarkerC2_At2g27290的扩增序列是一个番茄S.lycopersicum的抗病基因Pto的激发子PtoR(AW039031)的相似序列,两者之间的共有序列有96%的同源性;但是渐渗系扩增片断长度为1113bp,其中的836bp是与AW039031不同的插入序列。