背景与目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发病率在全球范围内排在所有恶性肿瘤的第六位,起病隐匿,进展迅速,确诊时大约85%的患者已属于中晚期。目前,肝癌的治疗措施中有望获得治愈的方法有手术切除、肝移植和局部消融,但这些方法仅适用于肝癌早期的患者。对于大部分肝癌晚期的患者,目前仍缺乏有效的治疗方法。此外,即使接受了手术切除、肝移植或局部消融治疗,患者的长期预后也并不理想,主要的原因是复发率高。近年来,随着对分子发病机制的深入研究,多条与肝细胞肝癌发生、发展相关的信号通路被阐明,并由此催生了肝癌的分子靶向治疗。索拉非尼是目前唯一一个被批准用于治疗肝细胞肝癌的分子靶向药物。最近的随机对照临床研究显示,与安慰剂相比,索拉非尼可以使晚期肝癌患者的中位生存时间延长2-3个月。临床研究的结果不仅确立了分子靶向药物在晚期肝细胞肝癌治疗中的地位,而且极大地鼓舞了科学家们去寻找新的、更有效的分子治疗靶点。哺乳动物雷帕鸣靶蛋白(]mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝／苏氨酸蛋白激酶,在进化过程中高度保守,广泛地参与细胞增殖、分化、凋亡和自噬等多种细胞功能的调节。mmTOR可以和不同的蛋白结合形成mTOR复合物1(mTOR complex 1, mTORC1) 和 mTOR复合物2(mTOR complex 2, mTORC2)。据文献报道,50%的肝细胞肝癌中存在着mTOR信号通路(PI3KAKTmTOR)异常激活的现象。因此,mTOR被认为是一个非常有前景的治疗肝细胞肝癌的分子靶点。在目前的临床研究中,针对mTOR信号通路分子靶向治疗的药物主要是传统的单mTORC1抑制剂——雷帕鸣及其衍生物,这类药物只能抑制mTORC1的功能,对mTORC2无效。从目前的临床数据来看,雷帕鸣及其衍生物对肝细胞肝癌的治疗远远没有达到预期的临床效果,可能的原因是雷帕鸣及其衍生物不能完全地抑制mTORCl的活性,对mTORC2无效,以及反馈性地激活了AKT信号。因此,科学家们希望能够研发一种即可以阻断mTORC1信号,同时又可以阻断mTORC2信号的新型双mTOR抑制剂。目前已经研发出了多种双mTOR抑制剂,如PP244、INK126、Torin 1、WYE-125132、AZD8055 和 AZD2014等,其中研究最为广泛的是AZD8055。但是AZD8055在生物体内代谢过快,药物代谢动力学不稳定,而AZD2014具有更好的水溶性和药物代谢动力学,有利于其临床应用。目前,尚未见双rnTORC1/2抑制剂AZD2014对肝细胞肝癌抗癌作用的研究报道。此外,肝移植是治疗肝细胞肝癌的重要措施之一,具有其它治疗方法无法比拟的优点。特别是符合“米兰标准”的肝细胞肝癌患者,接受肝移植治疗后,4年的存活率可高达85%,而且复发率低于15%。肝移植术后,需要长期应用免疫抑制剂,从理论上来说,免疫抑制剂的使用会增加肝癌的复发率。如果免疫抑制剂本身具有抗癌作用,或许可以降低移植术后肝癌的复发率。mTOR信号通路在免疫调节中具有重要的作用,并且传统的单mTORC1抑制剂雷帕鸣也是临床上肝移植术后常用的免疫抑制剂。但是,双mTORC1/2抑制剂AZD2014是否具有抑制肝移植术后急性排斥反应的作用,目前尚未见相关文献报道。本研究,首先在体外探讨AZD2014对人肝癌细胞株mTORC1和mTORC2信号通路的作用,及其对肝癌细胞株增殖、凋亡、周期、自噬、迁移、侵袭和EMT的影响；其次,在裸鼠体内验证AZD2014对肝细胞肝癌是否具有抗癌作用；最后,在同种异基因大鼠肝移植模型中验证AZD2014是否具有抑制肝移植术后急性排斥反应的作用。为双mTORC1/2抑制剂AZD2014在肝细胞肝癌分子靶向治疗和肝癌肝移植中的临床应用提供理论依据。第一章双mTORCl/2抑制剂AZD2014在体外对人肝癌细胞株的影响目的体外研究双mTORCl/2抑制剂AZD2014对肝癌细胞mTORCl和mTORC2信号通路的作用,及其对肝癌细胞增殖、凋亡、周期、自噬、迁移、侵袭和EMT的影响。细胞株人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721和HepG2,以及人永生化肝细胞株HL-7702均购于中国科学院上海细胞库。方法1.人肝细胞株和人肝癌细胞株中mTORC1和mTORC2的活化状态。用Western blot检测人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721、HepG2和永生化的人肝细胞株HL-7702基础状态下mTORC1和mTORC2的活化水平。以P-S6K Thr389和 p-4EBP1 Thr37/46的磷酸化水平反应：nTORC1的活化状态,以p-AKT Ser473的磷酸化水平反应mTORC2的活化状态。2.AZD2014对人肝癌细胞mTORC1和mTORC2信号通路的影响。选择人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2为研究对象。实验组给予梯度浓度(0-1000 nM)的AZD2014处理,对照组给予梯度浓度(0-1000 nM)的雷帕鸣处理。处理1小时后提取各细胞株总蛋白,进行Westernblot检测P-S6K Thr389、 p-4EBP1 Thr 37/46 和 p-AKT Ser 473表达水平的变化。3.AZD2014对人肝癌细胞增殖的影响。选择人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2为研究对象。将肝癌细胞接种于96孔板中,每孔4000-8000个细胞,接种12小时后加药处理。实验组给予梯度浓度(0-20000 nM)的AZD2014处理,对照组给予梯度浓度(0-20000 nM)的雷帕鸣处理。处理72小时后,利用CCK-8试剂盒检测肝癌细胞增殖的情况,并计算药物的半数抑制浓度(IC50)。4.AZD2014对人肝癌细胞凋亡的影响。选择人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2为研究对象。实验组给予AZD2014处理,剂量为各细胞株相对应的IC50,雷帕鸣组给予相同剂量的雷帕鸣处理,对照组给予DMSO处理。处理48小时后,首先利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒流式检测各组肝癌细胞的凋亡比例；然后再用TUNEL法荧光显微镜下观察各组肝癌细胞凋亡的情况,TUNEL染色阳性的细胞,在镜下发绿光；最后进行Western blot检测各组肝癌细胞中促凋亡相关分子Bax、CleavedPARP和Cleaved caspase-3的表达水平。5.AZD2014对人肝癌细胞周期的影响。选择人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2为研究对象。实验组给予AZD2014处理,剂量为各细胞株相对应的IC50,雷帕鸣组给予相同剂量的雷帕鸣处理,对照组给予DMSO处理。处理48小时后,利用流式细胞仪检测各组肝癌细胞周期的变化；然后再利用Western blot方法检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4的表达水平。6.AZD2014对人肝癌细胞自噬的影响。选择人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2为研究对象。实验组给予AZD2014处理,剂量为各细胞株相对应的IC50,雷帕鸣组给予相同剂量的雷帕鸣处理,对照组给予DMSO处理。细胞处理48小时后,利用MDC(monodansylcadaveri (?)e)染色的方法检测各组肝癌细胞中自噬囊泡的变化；然后再利用Western blot检测细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ 和 Beclin-1的表达水平。7.AZD2014对人肝癌细胞迁移、侵袭和EMT的影响。选择人肝癌细胞株HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2为研究对象。实验组给予AZD2014处理,剂量为各细胞株相对应的IC50,雷帕鸣组给予相同剂量的雷帕鸣处理,对照组给予DMSO处理。处理48小时后,首先进行Transwell细胞迁移实验,计数迁移穿过Transwell小室的细胞数；然后进行Transwell侵袭实验,计数侵袭穿过Transwell小室的细胞数；最后进行Western b lot检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和MMP2的表达水平。结果1.以p-S6K Thr 389 和 p-4EBP1 Thr 37/46的磷酸化水平反应mTORC 1的活化状态,以pAKT Ser 473的磷酸化水平反应mTORC2的活化状态。四株肝癌细胞HCCLM3.Huh-7、SMMC-7721 和 HepG2 中 p-S6K Thr 389 和 p-4EBPl Thr 37/46的表达水平均高于人肝细胞株HL-7702；但在这四株肝癌细胞中,只有SMMC-7721细胞中p-AKT Ser473的表达水平高于人肝细胞株HL-7702。2.低浓度(10-100nM)的AZD2014可以非常有效地抑制肝癌细胞中p-S6KThr389、p-4EBP1 Thr 37/46 和 p-AKT Ser473的表达水平；而雷帕鸣只能有效地抑制肝癌细胞中p-S6K Thr389 的表达水平,对 p-4EBP1 Thr37/46的表达水平几乎没有影响,但是对p-AKT Ser473的表达水平具有促进作用。3.AZD2014可以显著地抑制HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721和HepG2细胞的增殖,而雷帕鸣对肝癌细胞增殖的抑制作用显著小于AZD2014,特别是对SMMC-7721细胞,雷帕鸣无效(P值均<0.05)。AZD2014对肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50):HCCLM3为101.6 nM、Huh-7为441.61nM、SMMC-7721为141 nM、HepG2为600 nM,而雷帕鸣对四株肝癌细胞的半数抑制浓度远远大于AZD2014。4.首先,Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒流式检测发现,AZD2014和雷帕鸣都可以诱导HCCLM3和Huh-7细胞发生凋亡,但AZD2014诱导肝癌细胞凋亡的能力显著大于雷帕鸣(P值均<0.05)；而在SMMC-7721和HepG2细胞中,AZD2014和雷帕鸣均未能诱导肝癌细胞发生显著凋亡。其次,TUNEL法检测发现,在HCCLM3和Huh-7细胞中,AZD2014组和雷帕鸣组中TUNEL染色阳性的细胞数显著多于对照组,其中AZD2014组TUNEL染色阳性的细胞数又显著多于雷帕鸣组。但是在SMMC-7721 和 HepG2细胞甲,AZD2014组、雷帕鸣组和对照组中TUNEL染色阳性的细胞无显著差别。最后,Western blot检测发现AZD2014和雷帕鸣可以上调HCCLM3和Huh-7细胞中促凋亡相关分子Bax、 Cleaved PARP和Cleaved caspase-3的表达水平；而在SMMC-7721和HepG2　胞中, AZD2014和雷帕鸣对细胞内促凋亡相关分子Bax、Cleaved PARP 和 Cleaved caspase-3的表达水平无显著影响。5.流式细胞仪检测细胞周期发现,AZD2014处理HCCLM3、Huh-7、 SMMC-7721和HepG2细胞后,四株肝癌细胞的G1期细胞百分比显著高于雷帕鸣组和对照组(P值均<0.05),同时S期的细胞百分比显著低于雷帕鸣组和对照组(P值均<0.05)；雷帕鸣处理HCCLM3和Huh-7细胞后,G1期细胞的百分比显著高于对照组(P值均<0.05),同时S期细胞的百分比显著低于对照组(P值均<0.05)；但在SMMC-7721和HepG2细胞中,雷帕鸣处理前后G1期和S期的细胞百分比变化不大。Western blot检测发现AZD2014处理HCCLM3、 Huh-7、SMMC-7721和HepG2细胞后,细胞内促进G1-S期转换的细胞周期调控蛋白Cyclin D1 和 CDK4较对照组显著下降。6.MDC染色发现AZD2014处理HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721和HepG2细胞后,四株肝癌细胞中MDC染色囊泡的数量和体积显著大于对照组,并且MDC染色囊泡可以被自噬抑制剂(3-MA)抑制；而雷帕鸣只能使HCCLM3和Huh-7细胞中MDC染色囊泡增多、增大；在SMMC-7721和HepG2细胞中雷帕鸣处理前后MDC染色囊泡未见显著变化。Western blot检测发现AZD2014处理HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721口HepG2细胞后,四株肝癌细胞中LC3B-Ⅱ的表达水平均显著高于对照组和雷帕鸣组(P值均<0.05)；而雷帕鸣只能使HCCLM3和Huh-7细胞中LC3B-Ⅱ和Beclin-1的表达水平增高(P值均<0.05)；在SMMC-7721和HepG2细胞中雷帕鸣处理前后LC3B-Ⅱ和Beclin-1 的表达水平未见显著变化(P值均>0.05)。7.首先,Transwel1迁移实验发现AZD2014处理后,四种肝癌细胞株迁移穿过Transwell小室的细胞数显著少于雷帕鸣组和对照组(P值均<0.05)；雷帕鸣处理后,四种肝癌细胞株迁移穿过Transwell小室的细胞数也显著少于对照组(P值均<0.05)。其次,Transwell侵袭实验发现AZD2014处理后,四种肝癌细胞株侵袭穿过Transwell小室的细胞数显著少于雷帕鸣组和对照组(P值均<0.05)；雷帕鸣处理后,四种肝癌细胞株侵袭穿过Transwell小室的细胞数也显著少于对照组(P值均<0.05)。最后,Western blot检测发现AZD2014处理HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721和HepG2细胞后,四株肝癌细胞中上皮细胞表型蛋白E-cadherin的表达水平较对照组显著升高,而间质细胞表型蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail 和 MMP2的表达水平较对照组显著降低；雷帕鸣也可以产生相似的效果,但作用不如AZD2014明显。结论1.以永生化的人肝细胞HL-7702为基准,人肝癌细胞株中普遍存在着mTORC1信号通路异常激活的现象,但mTORC2只在部分肝癌细胞株(SMMC-7721)中存在异常激活的现象。2.在肝癌细胞中,AZD2014是一种高效的mTORC1和nTORC2抑制剂。与传统的单mTORC1 抑制剂雷帕鸣相比,双mTORC1/2抑制剂AZD2014不仅可以更彻底地阻断mTORC1信号,还可以阻断mTORC2信号,防止反馈性地激活AKT信号。3.体外研究显示双mTORC1/2抑制剂AZD2014具有强大的抗肿瘤作用。与传统的单mTORC1抑制剂雷帕鸣相比,AZD2014 在抑制人肝癌细胞增殖,诱导人肝癌细胞发生凋亡、G1/S期阻滞和自噬,以及在抑制人肝癌细胞迁移、侵袭和EMT方面,具有更强大的作用。第二章双mTORC1/2抑制剂AZD2014在体内对肝细胞肝癌的影响目的体内研究验证双mTORC1/2抑制剂AZD2014对肝细胞肝癌是否具有抗肿瘤作用。细胞株和裸鼠人肝癌细胞株HCCLM3购于中国科学院上海细胞库。雄性BALB/C裸鼠购于广东省医学动物实验中心。方法将5×106个人肝癌细胞HCCLM3接种至裸鼠右侧腰腹部的皮下,待形成明显的质硬瘤块后(接种后第10天),将裸鼠随机分成2组(对照组和AZD2014组),每组各5只。AZD2014组腹腔内注射AZD2014药物,5 mg/kg体重,1次/天；对照组腹腔内注射药物溶剂2.5 ml/kg体重,1次/天。定期测量裸鼠皮下肿瘤的最长径(a)和与其相对应的正中垂直线(b),从给药当天开始测量,每4天测量一次,计算肿瘤体积并绘制肿瘤体积增长曲线。给药后第24天(即细胞接种后的第34天)处死裸鼠,剥离皮下肿瘤,测量肿瘤的重量,留取肿瘤组织进行HE染色和免疫组织化学检测细胞增殖、凋亡和EMT相关蛋白。肿瘤体积结果AZD2014组皮下肿瘤的体积自给药后几乎未再增大,而对照组中的肿瘤体积随着时间的延长而不断增大(P值<0.05)。AZD2014组皮下肿瘤的重量显著小于对照组(P值<0.05)。HE染色显示 AZD2014组中发生坏死的细胞显著多于对照组。免疫组化检测发现AZD2014组中细胞增殖核抗原Ki-67和血管内皮细胞标志蛋白CD31的表达量显著低于对照组,而促凋亡蛋白Cleaved caspase-3显著高于对照组；此外,AZD2014组间质细胞表型蛋白N-cadherin 和 Vimentin的表达水平显著低于对照组,而上皮细胞表型蛋白E-cadherin的表达水平则显著高于对照组。结论体内研究显示双]mTORC1/2抑制剂AZD2014对肝细胞肝癌具有强大的抗肿瘤作用,可以抑制肝癌细胞的增殖、微血管形成和EMT进程,同时还可以促进肝癌细胞发生坏死和凋亡。第三章双mTORC1/2抑制剂AZD2014在大鼠肝移植中的抗排斥作用目的在同种异基因大鼠肝移植模型中验证AZD2014是否具有抑制肝移植术后急性排斥反应的作用。大鼠雄性Lewis大鼠和Brown Norway(BN)大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。方法采用Kamada提出的“二袖套”法建立kwis→BN 同种异基因大鼠肝移植急性排斥反应模型,将移植术后的BN大鼠分成2组(对照组和AZD2014组),每组各4只。AZD2014组从术后第一天开始,腹腔内注射AZD2014药物,5mg/kg体重,1次/天；对照组从术后第一天开始,腹腔内注射药物溶剂25 ml/kg体重,1次/天。分别于术前第3天和术后第1、3、5、7、10、14天取外周血检测肝功能(ALT、AST和TBIL)。观察终点：大鼠死亡或术后生存时间≥14天,记录生存时间,进行生存分析。观察终点出现后,收集移植肝脏。移植肝脏进行天狼星红染色,评估移植物纤维化的程度；移植肝脏行免疫组化检测CD3和Foxp3的表达水平,评估移植物中T淋巴细胞和Treg淋巴细胞浸润的程度；移植肝脏行HE染色,采用Banff方案评估肝移植术后排斥反应的严重程度。结果对照组在术后14天内有75%的大鼠死亡,血清ALT、AST和TBIL进行性升高,病理检查显示移植肝内有严重的排斥反应,大量的T淋巴细胞(CD3阳性)浸润和纤维化形成；而AZD2014组在术后14天内无大鼠死亡,血清ALT、AST和TBIL持续维持在低水平状态,移植肝内未见典型的排斥反应病理改变。此外,免疫组化结果显示AZD2014组移植肝脏中Foxp3阳性细胞浸润的数量显著高于对照组。结论双mTORC1/2抑制剂AZD2014可以有效地抑制同种异基因大鼠肝移植术后的急性排斥反应。