蚯蚓纤溶酶Efp-0和Efp-Ⅱ基因的克隆与表达

来源 :河北大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:yangor2008
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蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)是一类在蚯蚓体内分离到的具有纤溶蛋白作用和激活纤溶酶原作用的蛋白质,具有抗凝、纤溶和溶栓作用,可以作为溶栓药物治疗因血栓引起的各种疾病。在其分子生物学研究方面,国内外学者分别在GenBank中递交了24条核酸序列和31条蛋白质序列(24条通过核酸序列翻译所得,7条是直接报道的部分蛋白质序列)。根据N-末端氨基酸序列比对,这些序列与Mihara H报道的4组EFE(F-Ⅰ-0、F-Ⅰ、F-Ⅱ、F-Ⅲ)中的3组一致或相似性极高,但与F-Ⅰ-0组分序列一致的核酸序列此时尚未见报道。   本实验前期已经利用DNAMAN软件,从正蚓科(Lumbricidae)的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,电子克隆得到一个EfP-0的序列,根据该序列设计特异引物,经过RT-PCR反应成功地从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为Efp-0。Efp-0基因全长678bp,编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明Efp-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40%,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,Genbank登录号为DQ836917。构建了pMAL-c2x-Efp-0重组质粒,在E.coli TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板及纤维蛋白平板溶解活性。   根据Genbank中已报道的F-Ⅱ组分的基因设计引物,从蚯蚓总RNA中经Touchdown PCR结合热启动的方法得到了Efp-Ⅱ基因,Genbank登录号为DQ836918。构建了pMAL-c2x-Efp-Ⅱ重组质粒,并在E.coli TB1中获得了融合蛋白MBP-EfP-Ⅱ的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板及纤维蛋白平板溶解活性。
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