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本研究旨在将抗B7-H4单链抗体与人IgG1 CH3进行连接,对抗B7-H4单链抗体进行人源化改造,希望得到对肿瘤生长有抑制作用的融合蛋白。本实验室的先前研究中,已构建出抗B7-H4单链抗体库,并且利用核糖体展示技术筛选出一株鼠源性抗B7-H4的特异性单链抗体。可是,因为该株单链抗体缺少Fc段,造成其在体内的半衰期短、在血液中容易被清除,且也造成了其在鉴定方面的繁杂。因此,我们将anti-B7-H4-scFv基因与人IgGlCH3基因相连,以此对单链抗体进行人源化改造。具体结果如下:1 Anti-B7-H4-scFv-CH3 基因的克隆从人外周血单个核细胞中提取总RNA,然后用RT-PCR扩增出人IgG1 CH3基因;利用SOE-PCR技术将anti-B7-H4-scFv基因和人IgGlCH3基因进行连接来获得重组基因;再通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序鉴定重组基因。结果表明:重组的anti-B7-H4-scFv-CH3基因序列和期望的一致。2 Anti-B7-H4-scFv-CH3蛋白的表达、纯化及活性检测将重组基因克隆到原核表达载体pET43.1a中,转化至E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达出抗体蛋白;抗体蛋白再经镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化,纯化后的蛋白经Western blot鉴定;用ELISA和Western blot鉴定抗体蛋白和B7-H4抗原结合的特异性和亲和性。结果表明:成功构建了抗B7-H4人源化单链抗体的表达体系,获得与B7-H4抗原亲和性和特异性高的可溶性蛋白。3 Anti-B7-H4-scFv-CH3蛋白的生物学功能检测为了检测抗体蛋白的生物学功能,用C57BL/6小鼠建立了 Lewis肺癌皮下移植瘤模型;将荷瘤鼠随机分成两组,注射生理盐水的为模型组,注射anti-B7 -H4-scFv-CH3蛋白的为受试药组,并从此刻开始记录两组小鼠肿瘤体积和小鼠体重的变化,实验结束时处死小鼠剥离瘤块进行称重,并对肿瘤组织进行苏木精-伊红染色观察组织病理学形态。结果表明:对照组的肿瘤体积和瘤重普遍大于实验组;光镜下观察,实验组肿瘤细胞排列密度较对照组低且见病灶性坏死;抗体蛋白可以抑制Lewis荷瘤小鼠肿瘤的生长,显示出良好的生物学功能活性。Anti-B7-H4-scFv-CH3这一功能蛋白为肿瘤的靶向治疗等方面的研究提供了基础。