论文部分内容阅读
背景与目的
肝细胞癌是死亡率居高的恶性肿瘤之一，其发病隐匿、放化疗不敏感且极易复发转移，临床首选手术治疗，但术后5年生存率极低，预后差。研究表明大部分肝癌为典型的炎性相关性恶性肿瘤，其发生发展过程中伴随着从炎症微环境到肿瘤免疫微环境的转变，免疫微环境中的各类因子在肿瘤的演进中发挥重要作用，因此寻找免疫微环境中影响肝癌发生发展的分子、遴选特异性治疗靶标是当前关注的热点。
CHD1L基因位于染色体1q21区，在多种实体肿瘤中有异常扩增及表达。我们课题组前期研究发现CHD1L与肝癌细胞干性特征有关；胚肝在发育过程中有短暂的CHD1L表达，随着肝细胞发育及分化成熟CHD1L表达沉默，即CHD1L经历了一过性高表达到表达消失的过程，而病理条件下分化异常的肝细胞将再度出现CHD1L表达；体内、外实验中我们发现EGF、GDNF等生长因子通过其受体活化下游信号通路，上调CHD1L表达。上述实验结果提示特定微环境中存在调控CHD1L表达的诱导因子。免疫微环境与肿瘤恶性进展的关系已被众多研究证实，其极可能以同样的方式促进CHD1L表达进而影响肿瘤细胞的表型，但肿瘤免疫微环境中哪些因子是CHD1L表达的诱导因子、其调控机制如何目前均不清楚，本文拟对此进行研究，阐述其相关机制。
方法
1、体外诱导人单核白血病细胞系THP-1分化为M2型巨噬细胞，模拟体内肿瘤免疫微环境，建立肝癌Huh7、QGY-7703细胞与M2型巨噬细胞共培养体系；
2、细胞因子抗体芯片筛选M2型巨噬细胞与肝癌细胞共培养体系中差异表达因子；ELISA验证共培养上清中差异表达因子的表达；qRT-PCR检测外源性加入差异表达因子对肝癌细胞Chd1l表达的影响，确定可激活Chd1l转录的关键因子；
3、qRT-PCR及WesternBlot检测主要差异表达因子对肝癌细胞CHD1L表达的影响；
4、MTS、细胞划痕、Transwell侵袭及体外成球实验观察外源性添加差异表达因子或敲除肝癌细胞Chd1l条件下肝癌细胞恶性表型的变化；
5、阻断相关因子受体及其下游信号通路后，观察外源性因子及其下游信号通路对CHD1L促肝癌细胞恶性表型作用的影响效果，明确其调控关系。
结果
1、细胞形态学结果显示类圆形悬浮生长的THP-1细胞被PMA成功诱导分化为聚集贴壁生长、胞体增大、呈不规则长梭形并伸出伪足的未极化巨噬细胞(UaM)；qRT-PCR和流式细胞分析结果显示经IL-4及IL-13刺激后UaM表达M2型巨噬细胞表面标志分子CD163和CD206；ELISA结果显示与UaM相比，M2型巨噬细胞培养上清中IL-10明显增多，提示替代性活化巨噬细胞诱导成功。
2、细胞因子抗体芯片检测结果显示与与肝癌细胞单独培养组相比，M2型巨噬细胞共培养组有30个细胞因子表达上调；挑选差异倍数高且与肝癌发生相关的6种细胞因子CXCL1(71倍)、CSF-2(60倍)、CCL3(57倍)、CCL20(56倍)、CCL1(26倍)和ICAM-1(6倍)进行验证，观察上述因子对CHD1L表达的影响。qRT-PCR检测结果显示CXCL1与CCL20可上调肝癌细胞CHD1L表达，其中CXCL1的上调作用更为显著，余未见明显作用；ELISA检测结果显示与对照组相比，M2型巨噬细胞与Huh7、QGY-7703共培养体系上清中CXCL1含量明显增多，且以共培养组增多更明显；qRT-PCR检测结果显示共培养后M2型巨噬细胞和肝癌细胞CXCL1的mRNA表达均明显升高，但肝癌细胞中CXCL1的表达上调作用更为明显。
3、在CXCL1作用下，CXCL1受体CXCR2的表达增高，同时QGY-7703及Huh7细胞CHD1L表达明显上调，CXCL1处理72h后CHD1L的表达水平回落；CXCR2中和抗体封闭受体后再给予CXCL1，不能回调CHD1L的表达。
4、CXCL1作用下QGY-7703和Huh7细胞细胞增殖率无明显变化，但细胞划痕及Transwell实验结果显示细胞的迁移、侵袭能力明显高于对照组；qRT-PCR及Westernblot检测结果显示CXCL1处理细胞后QGY-7703及Huh7细胞中Nanog、OCT-4、SOX2等干性相关基因表达出现明显上调，而先用CXCR2中和抗体处理后再添加CXCL1，上述基因表达则下调；体外成球实验结果显示CXCL1作用下细胞成球率明显增高。用相同剂量的CXCL1处理7703-CHD1L-KO稳转细胞系(不加或加强力霉素即DOX的情况下，CHD1L过表达或被敲除)，qRT-PCR、WesternBlot及细胞表型实验检测结果显示当敲除CHD1L时，Nanog、OCT-4、SOX2mRNA和蛋白表达水平、细胞迁移、侵袭、成球能力均下降，CXCL1无明显作用。
5、CXCL1处理QGY-7703和Huh7细胞后，CXCL1-CXCR2下游信号通路中关键分子AKT、MEK、ERK的磷酸化水平有不同程度的升高，其中p-AKT的表达上调最明显，而FAK磷酸化水平无明显变化；经中和抗体封闭CXCR2后AKT磷酸化水平明显下降，与对照组无明显差异。用PI3K抑制剂LY294002及CXCL1(40ng/ml)依次处理细胞，结果显示随着LY294002浓度增加及作用时间延长，CHD1L呈现不同程度的下调，此时给予CXCL1，CHD1L的表达未见明显回调。
结论
1、M2型巨噬细胞与肝癌细胞共培养体系中趋化因子CXCL1是上调CHD1L表达的主要因子；
2、CXCL1可促进肝癌细胞的恶性表型；
3、CXCL1/CXCR2通过活化PI3K/AKT信号通路上调CHD1L表达，进而促进肝癌细胞的恶性表型。
肝细胞癌是死亡率居高的恶性肿瘤之一，其发病隐匿、放化疗不敏感且极易复发转移，临床首选手术治疗，但术后5年生存率极低，预后差。研究表明大部分肝癌为典型的炎性相关性恶性肿瘤，其发生发展过程中伴随着从炎症微环境到肿瘤免疫微环境的转变，免疫微环境中的各类因子在肿瘤的演进中发挥重要作用，因此寻找免疫微环境中影响肝癌发生发展的分子、遴选特异性治疗靶标是当前关注的热点。
CHD1L基因位于染色体1q21区，在多种实体肿瘤中有异常扩增及表达。我们课题组前期研究发现CHD1L与肝癌细胞干性特征有关；胚肝在发育过程中有短暂的CHD1L表达，随着肝细胞发育及分化成熟CHD1L表达沉默，即CHD1L经历了一过性高表达到表达消失的过程，而病理条件下分化异常的肝细胞将再度出现CHD1L表达；体内、外实验中我们发现EGF、GDNF等生长因子通过其受体活化下游信号通路，上调CHD1L表达。上述实验结果提示特定微环境中存在调控CHD1L表达的诱导因子。免疫微环境与肿瘤恶性进展的关系已被众多研究证实，其极可能以同样的方式促进CHD1L表达进而影响肿瘤细胞的表型，但肿瘤免疫微环境中哪些因子是CHD1L表达的诱导因子、其调控机制如何目前均不清楚，本文拟对此进行研究，阐述其相关机制。
方法
1、体外诱导人单核白血病细胞系THP-1分化为M2型巨噬细胞，模拟体内肿瘤免疫微环境，建立肝癌Huh7、QGY-7703细胞与M2型巨噬细胞共培养体系；
2、细胞因子抗体芯片筛选M2型巨噬细胞与肝癌细胞共培养体系中差异表达因子；ELISA验证共培养上清中差异表达因子的表达；qRT-PCR检测外源性加入差异表达因子对肝癌细胞Chd1l表达的影响，确定可激活Chd1l转录的关键因子；
3、qRT-PCR及WesternBlot检测主要差异表达因子对肝癌细胞CHD1L表达的影响；
4、MTS、细胞划痕、Transwell侵袭及体外成球实验观察外源性添加差异表达因子或敲除肝癌细胞Chd1l条件下肝癌细胞恶性表型的变化；
5、阻断相关因子受体及其下游信号通路后，观察外源性因子及其下游信号通路对CHD1L促肝癌细胞恶性表型作用的影响效果，明确其调控关系。
结果
1、细胞形态学结果显示类圆形悬浮生长的THP-1细胞被PMA成功诱导分化为聚集贴壁生长、胞体增大、呈不规则长梭形并伸出伪足的未极化巨噬细胞(UaM)；qRT-PCR和流式细胞分析结果显示经IL-4及IL-13刺激后UaM表达M2型巨噬细胞表面标志分子CD163和CD206；ELISA结果显示与UaM相比，M2型巨噬细胞培养上清中IL-10明显增多，提示替代性活化巨噬细胞诱导成功。
2、细胞因子抗体芯片检测结果显示与与肝癌细胞单独培养组相比，M2型巨噬细胞共培养组有30个细胞因子表达上调；挑选差异倍数高且与肝癌发生相关的6种细胞因子CXCL1(71倍)、CSF-2(60倍)、CCL3(57倍)、CCL20(56倍)、CCL1(26倍)和ICAM-1(6倍)进行验证，观察上述因子对CHD1L表达的影响。qRT-PCR检测结果显示CXCL1与CCL20可上调肝癌细胞CHD1L表达，其中CXCL1的上调作用更为显著，余未见明显作用；ELISA检测结果显示与对照组相比，M2型巨噬细胞与Huh7、QGY-7703共培养体系上清中CXCL1含量明显增多，且以共培养组增多更明显；qRT-PCR检测结果显示共培养后M2型巨噬细胞和肝癌细胞CXCL1的mRNA表达均明显升高，但肝癌细胞中CXCL1的表达上调作用更为明显。
3、在CXCL1作用下，CXCL1受体CXCR2的表达增高，同时QGY-7703及Huh7细胞CHD1L表达明显上调，CXCL1处理72h后CHD1L的表达水平回落；CXCR2中和抗体封闭受体后再给予CXCL1，不能回调CHD1L的表达。
4、CXCL1作用下QGY-7703和Huh7细胞细胞增殖率无明显变化，但细胞划痕及Transwell实验结果显示细胞的迁移、侵袭能力明显高于对照组；qRT-PCR及Westernblot检测结果显示CXCL1处理细胞后QGY-7703及Huh7细胞中Nanog、OCT-4、SOX2等干性相关基因表达出现明显上调，而先用CXCR2中和抗体处理后再添加CXCL1，上述基因表达则下调；体外成球实验结果显示CXCL1作用下细胞成球率明显增高。用相同剂量的CXCL1处理7703-CHD1L-KO稳转细胞系(不加或加强力霉素即DOX的情况下，CHD1L过表达或被敲除)，qRT-PCR、WesternBlot及细胞表型实验检测结果显示当敲除CHD1L时，Nanog、OCT-4、SOX2mRNA和蛋白表达水平、细胞迁移、侵袭、成球能力均下降，CXCL1无明显作用。
5、CXCL1处理QGY-7703和Huh7细胞后，CXCL1-CXCR2下游信号通路中关键分子AKT、MEK、ERK的磷酸化水平有不同程度的升高，其中p-AKT的表达上调最明显，而FAK磷酸化水平无明显变化；经中和抗体封闭CXCR2后AKT磷酸化水平明显下降，与对照组无明显差异。用PI3K抑制剂LY294002及CXCL1(40ng/ml)依次处理细胞，结果显示随着LY294002浓度增加及作用时间延长，CHD1L呈现不同程度的下调，此时给予CXCL1，CHD1L的表达未见明显回调。
结论
1、M2型巨噬细胞与肝癌细胞共培养体系中趋化因子CXCL1是上调CHD1L表达的主要因子；
2、CXCL1可促进肝癌细胞的恶性表型；
3、CXCL1/CXCR2通过活化PI3K/AKT信号通路上调CHD1L表达，进而促进肝癌细胞的恶性表型。