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研究背景与目的：
胃癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，其致死率一直居高不下。在我国，胃癌的发病率及死亡率均位居恶性肿瘤的第三位。胃癌的治疗方式主要以手术为主，辅以化疗及放疗。但是胃癌的转移以及化疗耐药一直是导致病人死亡的主要原因。因此，研究胃癌的转移机制及胃癌的化疗耐受机制是目前胃癌研究尚待攻克的重要课题。
长链非编码RNA(longnon-codingRNA，简称lncRNA)是近几年的研究热点。LncRNA具有明显的组织特异性与时空特异性，可在多个层面调控编码蛋白基因的表达与修饰，包括表观遗传调控、转录调控以及转录后调控。许多的研究已经证实lncRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用。深入研究lncRNA在肿瘤中的生物学行为，为揭示肿瘤转移与耐药的本质提供了重要契机。本研究通过建立胃癌组织以及癌旁组织lncRNA差异表达谱，发现并深入研究SGOL1-AS1的功能及其作用机制，为揭示胃癌转移与耐药机制提供新视角以及新的治疗、预后靶点。
研究方法：
1.利用高通量lncRNA芯片检测5对胃癌组织与其配对癌旁组织的lncRNA表达谱。通过实时荧光定量PCR验证胃癌lncRNA差异基因的表达。
2.构建带有SGOL1-AS1的重组慢病毒，通过慢病毒感染胃癌细胞SGC7901、BGC823构建稳定过表达SGOL1-AS1的细胞株；构建带有shSGOL1-AS1的重组慢病毒，通过重组慢病毒瞬时感染稳定过表达SGOL1-AS1的细胞株。通过荧光定量PCR检测细胞SGOL1-AS1的表达，以验证细胞株是否构建成功。
3.在SGOL1-AS1的过表达细胞株和干扰细胞株中，通过MTS实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验检测细胞增殖、侵袭能力以及细胞对药物敏感性的改变。
4.用SGOL1-AS1的过表达细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察成瘤情况并测量裸鼠体重及肿瘤大小。当肿瘤生长至一定大小，于腹腔注射5-Fu，继续观察成瘤情况并测量裸鼠体重及肿瘤大小。另外，用过表达SGOL1-AS1细胞株尾静脉注射构建体内转移模型，以及通过手术的方式构建胃癌原位移植模型，通过动物成像仪观察裸鼠肿瘤转移情况。
5.通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹、免疫荧光实验检测SGOL1-AS1对E-cadherin、Vimentin、zeb1、zeb2、snail1、Twist1的影响。另外，通过TGFβ诱导细胞发生EMT，观察细胞形态变化，通过蛋白印迹、免疫荧光实验检测E-cadherin、Vimentin、zeb1的表达。
6.提取GES1、SGC7901细胞核、浆RNA，实时荧光定量PCR检测SGOL1-AS1表达情况，进行SGOL1-AS1定位。
7.利用RNApull-down实验、质谱鉴定检测与SGOL1-AS1结合的蛋白。通过RNApull-down、RNA蛋白免疫沉淀(RIP)验证G3BP2与SGOL1-AS1的结合。
8.在过表达SGOL1-AS1的细胞株中干扰G3BP2，免疫荧光实验检测Twist1在细胞内的定位。
结果：
1.根据差异倍数大于2倍，P＜0.05标准，发现差异表达lncRNA有185个，其中上调的lncRNA有117个，下调的lncRNA有68个。挑取10个差异倍数大于4倍的lncRNA在18对胃癌组织与配对癌旁组织中进行qPCR验证，发现qPCR结果基本与芯片符合。其中SGOL1-AS1在癌/癌旁差异最为显著，在另外69对组织中验证结果与前相符，SGOL1-AS1在胃癌组织中低表达。根据病理资料进行统计学分析发现SGOL1-AS1与胃癌临床进展与转移相关。
2.成功构建稳定过表达SGOL1-AS1的细胞株。
3.通过体外细胞实验发现过表达SGOL1-AS1能够抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移能力，并能够增加胃癌细胞对5-Fu、DDP的敏感性(P＜0.05)；而干扰SGOL1-AS1能够促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移能力，并能够降低胃癌细胞对5-Fu、DDP的敏感性(P＜0.05)。
4.根据所绘制肿瘤生长曲线发现SGOL1-AS1能够抑制胃癌的增殖以及增加肿瘤对5-Fu的敏感性(P＜0.05)。在体内转移模型和胃癌原位移植模型中，通过动物成像仪观察到SGOL1-AS1能够抑制胃癌侵袭转移。
5.实时荧光定量PCR、蛋白印迹、免疫荧光实验发现SGOL1-AS1促进E-cadherin，抑制vimentin、zeb1、zed2、snail1的表达。通过TGFβ诱导细胞发生EMT，发现SGOL1-AS1抑制EMT的发生。
6.荧光定量PCR显示SGOL1-AS1在细胞中定位于细胞浆。
7.RNApull-down实验获取与SGOL1-AS1相互结合的分子，挑选出能被SGOL1-AS1特异性沉淀下来的蛋白分子并通过液相质谱鉴定的方法进行鉴别。质谱鉴定结果发现约40个蛋白与SGOL1-AS1结合，通过调研文献挑选G3BP2蛋白进行验证。通过RNApull-down、RIP实验验证发现G3BP2与SGOL1-AS1结合。
8.通过免疫荧光实验我们发现，当我们在胃癌细胞过表达SGOL1-AS1后，细胞中Twist1的定位在细胞质较对照组明显。当我们在过表达细胞干扰G3BP2后，发现Twist1的定位主要在细胞核。
结论：
1.成功建立lncRNA在胃癌的差异表达谱。
2.SGOL1-AS1与胃癌进展、侵袭转移相关，可能是胃癌侵袭转移潜在的肿瘤标志物。
3.SGOL1-AS1能够抑制胃癌侵袭转移、EMT表型，增加胃癌对化疗的敏感性。
4.SGOL1-AS1与G3BP2蛋白结合，绑定Twist1于细胞质，从而抑制EMT表型。
胃癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，其致死率一直居高不下。在我国，胃癌的发病率及死亡率均位居恶性肿瘤的第三位。胃癌的治疗方式主要以手术为主，辅以化疗及放疗。但是胃癌的转移以及化疗耐药一直是导致病人死亡的主要原因。因此，研究胃癌的转移机制及胃癌的化疗耐受机制是目前胃癌研究尚待攻克的重要课题。
长链非编码RNA(longnon-codingRNA，简称lncRNA)是近几年的研究热点。LncRNA具有明显的组织特异性与时空特异性，可在多个层面调控编码蛋白基因的表达与修饰，包括表观遗传调控、转录调控以及转录后调控。许多的研究已经证实lncRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用。深入研究lncRNA在肿瘤中的生物学行为，为揭示肿瘤转移与耐药的本质提供了重要契机。本研究通过建立胃癌组织以及癌旁组织lncRNA差异表达谱，发现并深入研究SGOL1-AS1的功能及其作用机制，为揭示胃癌转移与耐药机制提供新视角以及新的治疗、预后靶点。
研究方法：
1.利用高通量lncRNA芯片检测5对胃癌组织与其配对癌旁组织的lncRNA表达谱。通过实时荧光定量PCR验证胃癌lncRNA差异基因的表达。
2.构建带有SGOL1-AS1的重组慢病毒，通过慢病毒感染胃癌细胞SGC7901、BGC823构建稳定过表达SGOL1-AS1的细胞株；构建带有shSGOL1-AS1的重组慢病毒，通过重组慢病毒瞬时感染稳定过表达SGOL1-AS1的细胞株。通过荧光定量PCR检测细胞SGOL1-AS1的表达，以验证细胞株是否构建成功。
3.在SGOL1-AS1的过表达细胞株和干扰细胞株中，通过MTS实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验检测细胞增殖、侵袭能力以及细胞对药物敏感性的改变。
4.用SGOL1-AS1的过表达细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察成瘤情况并测量裸鼠体重及肿瘤大小。当肿瘤生长至一定大小，于腹腔注射5-Fu，继续观察成瘤情况并测量裸鼠体重及肿瘤大小。另外，用过表达SGOL1-AS1细胞株尾静脉注射构建体内转移模型，以及通过手术的方式构建胃癌原位移植模型，通过动物成像仪观察裸鼠肿瘤转移情况。
5.通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹、免疫荧光实验检测SGOL1-AS1对E-cadherin、Vimentin、zeb1、zeb2、snail1、Twist1的影响。另外，通过TGFβ诱导细胞发生EMT，观察细胞形态变化，通过蛋白印迹、免疫荧光实验检测E-cadherin、Vimentin、zeb1的表达。
6.提取GES1、SGC7901细胞核、浆RNA，实时荧光定量PCR检测SGOL1-AS1表达情况，进行SGOL1-AS1定位。
7.利用RNApull-down实验、质谱鉴定检测与SGOL1-AS1结合的蛋白。通过RNApull-down、RNA蛋白免疫沉淀(RIP)验证G3BP2与SGOL1-AS1的结合。
8.在过表达SGOL1-AS1的细胞株中干扰G3BP2，免疫荧光实验检测Twist1在细胞内的定位。
结果：
1.根据差异倍数大于2倍，P＜0.05标准，发现差异表达lncRNA有185个，其中上调的lncRNA有117个，下调的lncRNA有68个。挑取10个差异倍数大于4倍的lncRNA在18对胃癌组织与配对癌旁组织中进行qPCR验证，发现qPCR结果基本与芯片符合。其中SGOL1-AS1在癌/癌旁差异最为显著，在另外69对组织中验证结果与前相符，SGOL1-AS1在胃癌组织中低表达。根据病理资料进行统计学分析发现SGOL1-AS1与胃癌临床进展与转移相关。
2.成功构建稳定过表达SGOL1-AS1的细胞株。
3.通过体外细胞实验发现过表达SGOL1-AS1能够抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移能力，并能够增加胃癌细胞对5-Fu、DDP的敏感性(P＜0.05)；而干扰SGOL1-AS1能够促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移能力，并能够降低胃癌细胞对5-Fu、DDP的敏感性(P＜0.05)。
4.根据所绘制肿瘤生长曲线发现SGOL1-AS1能够抑制胃癌的增殖以及增加肿瘤对5-Fu的敏感性(P＜0.05)。在体内转移模型和胃癌原位移植模型中，通过动物成像仪观察到SGOL1-AS1能够抑制胃癌侵袭转移。
5.实时荧光定量PCR、蛋白印迹、免疫荧光实验发现SGOL1-AS1促进E-cadherin，抑制vimentin、zeb1、zed2、snail1的表达。通过TGFβ诱导细胞发生EMT，发现SGOL1-AS1抑制EMT的发生。
6.荧光定量PCR显示SGOL1-AS1在细胞中定位于细胞浆。
7.RNApull-down实验获取与SGOL1-AS1相互结合的分子，挑选出能被SGOL1-AS1特异性沉淀下来的蛋白分子并通过液相质谱鉴定的方法进行鉴别。质谱鉴定结果发现约40个蛋白与SGOL1-AS1结合，通过调研文献挑选G3BP2蛋白进行验证。通过RNApull-down、RIP实验验证发现G3BP2与SGOL1-AS1结合。
8.通过免疫荧光实验我们发现，当我们在胃癌细胞过表达SGOL1-AS1后，细胞中Twist1的定位在细胞质较对照组明显。当我们在过表达细胞干扰G3BP2后，发现Twist1的定位主要在细胞核。
结论：
1.成功建立lncRNA在胃癌的差异表达谱。
2.SGOL1-AS1与胃癌进展、侵袭转移相关，可能是胃癌侵袭转移潜在的肿瘤标志物。
3.SGOL1-AS1能够抑制胃癌侵袭转移、EMT表型，增加胃癌对化疗的敏感性。
4.SGOL1-AS1与G3BP2蛋白结合，绑定Twist1于细胞质，从而抑制EMT表型。