论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是继阿尔茨海默症之后世界上第二大神经退行性疾病。PD的主要病理特征是中脑黑质区多巴胺能神经元的死亡和缺失,黑质-纹状体多巴胺能系统功能退化,以及神经元内嗜酸性包涵体Lewy小体的形成。而PD的病因尚不清楚,现有的临床药物只能减弱、但不能根治帕金森病的症状,且副作用大。近年来,炎症和自由基假说的提出,为研发新药开辟新的方向。异银杏双黄酮是一种天然化合物,在中药银杏被首次发现,但含量较低,研究颇少。我们在前期的研究中发现,瑶族民间药物竹柏中含有较高的异银杏双黄酮,且在民间广泛应用于精神疾病的治疗。因此,本文主要探究异银杏双黄酮在帕金森体内体外模型上的作用,并研究其具体的作用机制,为天然药物在帕金森病的治疗上开辟新途径。实验方法:1.采用MPP~+诱导PD细胞模型:将细胞接种于96孔板,RA、TPA诱导分化为多巴胺能神经元表型,异银杏双黄酮干预24 h后,加入MPP~+刺激24 h,使用MTT法检测细胞活率;荧光分光光度计检测ROS的释放;qPCR法检测凋亡、抗氧化相关基因mRNA水平的变化;Western Blot检测凋亡、抗氧化以及神经营养因子蛋白水平的变化;免疫荧光检测原代神经元细胞突起长度的变化。2.采用MPTP诱导PD动物模型:应用行为学实验评估MPTP诱导的小鼠帕金森模型的建立;流式细胞仪检测小鼠外周血淋巴细胞亚型的表达以及腹腔巨噬细胞自噬能力的变化;ELISA试剂盒检测小鼠纹状体胶质细胞的激活情况;Western Blot检测小鼠纹状体PI3K/Akt/mTOR以及MAPK通路的表达变化。实验结果:1.细胞实验结果:MPP~+刺激诱导的SH-SY5Y细胞活率显著降低,而1μg/mL的异银杏双黄酮对其有显著改善作用(P<0.05);MPP~+刺激的细胞ROS释放显著增强,异银杏双黄酮能够有效抑制ROS的释放(P<0.01);qPCR、Western Blot检测凋亡Bax、Bcl-2、Caspase3(P<0.01),氧化应激Nrf2、HO-1、SOD、NQO-1等相关基因及蛋白(P<0.01),都表明MPP~+可以引起细胞凋亡以及氧化应激反应(P<0.01),而异银杏双黄酮可以有效改善细胞凋亡,并激活机体抗氧化系统抵抗MPP~+引起的氧化应激反应;在免疫荧光中实验中也可以看出异银杏双黄酮对神经元细胞突起的损伤也有改善作用(P<0.05)。2.动物实验结果:与MPTP诱导的帕金森模型组来说,异银杏双黄酮在小鼠爬杆、转棒及旷野的行为学实验中均有明显的改善作用(P<0.01);在外周系统中,也可以减缓MPTP导致的腹腔巨噬细胞自噬功能紊乱以及中枢自噬相关蛋白表达异常(P<0.05);异银杏双黄酮也会对MPTP引起的中枢神经胶质细胞的活化以及炎症因子的释放有抑制趋势。实验结论:1.MPP~+可以引起SH-SY5Y细胞活率的降低,ROS的释放增加,凋亡相关的基因与蛋白表达增高,激活细胞氧化应激反应,神经营养因子分泌减少等PD具有的反应,异银杏双黄酮有效地改善这些方面功能的异常,提示异银杏双黄酮通过调节机体抗氧化系统,增加神经营养因子分泌,最终调节凋亡相关基因蛋白的共同作用来改善MPP~+诱导的PD体外模型。2.异银杏双黄酮还可以改善MPTP诱导的小鼠帕金森运动功能障碍,通过调节中枢胶质细胞的激活和外周淋巴细胞浸润,以及外周和中枢自噬功能来改善帕金森症状。