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铝毒被认为是酸性土壤中植物生长的主要障碍因子,全球大约可耕地面积的30%是酸性土壤,大多分布在热带和亚热带地区,我国酸性土壤主要分布在长江以南及云贵川等地,约占耕地面积的20%。在正常条件下铝不会对植物造成伤害,但在pH小于5的条件下铝以A13+释放出来对植物产生毒害作用,胁迫植物产生过量的活性氧(ROS),如过氧化氢(H202)等,对植物产生毒害作用。为了清除活性氧(ROS),植物形成了一些保护机制,主要包括非酶促脱毒机制和酶促脱毒机制。过氧化物酶(peroxidase)是酶促脱毒机制的一种,能够氧化分解生物胁迫和非生物胁迫环境下植物细胞产生的H202,缓解胁迫环境下植物受到的毒害作用。另外,硝太氮和铵态氮是植物主要利用的两种矿质态氮,在旱地酸性土壤中硝态氮的含量远大于铵态氮,植物对硝态氮的吸收和利用对植物的生长起着重要作用。然而铝毒对硝态氮吸收的影响比较大,但其机理仍不清楚。本研究在烟草中过量表达拟南芥POD基因,通过分析不同浓度铝胁迫下转基因烟草根相对生长率(RRG)、H2O2、MDA、可溶性蛋白含量、柠檬酸分泌量及氢泵活性、硝态氮吸收量、H+-ATPase活性及其与14-3-3蛋白互作水平,阐明POD清除H202与铝耐受性的关系,揭示铝胁迫下POD提高烟草植株铝耐受性和硝态氮吸收的机理,为理解POD在抗氧化胁迫中发挥着重要的作用提供科学依据。主要结果如下:1、获得了转POD基因烟草植株。从拟南芥中分离到POD基因,并构建pK2-35S-POD植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草,经卡那霉素筛选,PCR和western检测,获得了转POD基因烟草株系。转基因烟草POD活性是野生型烟草的1.2-1.6倍。2、转POD基因烟草比野生型烟草耐铝能力强。用不同浓度铝处理WT和POD植株12小时,测得转基因烟草根的相对生长率(RRG)比WT的相对生长率显著增加;转基因烟草的H2O2含量明显低于WT,而质膜H+-ATPase、氢泵活性及柠檬酸的分泌量明显高于WT;免疫共沉淀分析转基因烟草质膜H+-ATPase与14-3-3互作水平也高于WT。这些实验结果表明POD转基因植株通过降低细胞中的活性氧H2O2,提高质膜H+-ATPase和氢泵活性以及质膜H+-APase磷酸化及其与14-3-3蛋白的互作水平来促进植物柠檬酸的分泌提高对铝毒的耐受性。转POD基因烟草在酸性土壤上的生长明显优于WT更进一步证明转POD基因烟草具有较强的耐铝性。3、转POD基因烟草能够促进对硝态氮的吸收。不同浓度铝处理结合15mmol NO3-处理转POD烟草植株和WT植株1d和4d,分析植物对硝态氮的吸收情况表明,随着铝浓度的增加,硝态氮的吸收量逐渐降低,但在相同铝浓度条件下转POD烟草植株对硝态氮的吸收量明显高于WT,处理1d和处理4d相比,处理1d植株对硝态氮的吸收量多于4d。为进一步分析POD蛋白促进植株吸收硝态氮的分子机理,检测用200μmol铝(0μmol为对照)处理POD和WT植株1d后植株根尖质膜H+-ATPase和氢泵活性及质膜H+-ATPase与14-3-3互作水平的变化,结果表明200μmol铝处理植株1d后,POD转基因植株氢泵活性、质膜H+-ATPase活性及质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白互作水平与对照比较均降低,但这三项指标均高于WT。这表明POD可能通过减少H202的过量积累提高PM H+-ATPase磷酸化水平及与14-3-3蛋白的互作水平提高质膜H+-ATPase活性及氢泵活性来促进植株对氮素营养的吸收。4、转POD基因烟草促进对硝态氮的吸收与14-3-3和质膜H+-ATPase有关。分别用铝处理质膜H+-ATPase过量表达植株(AGHA2-3)、抑制表达植株(RP1)和14-3-3过量表达植株(S23)和抑制表达植株(RE10)1d和4d,分析硝态氮的吸收量及质膜H+-ATPase、氢泵活性及质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白互作水平,结果表明处理1d和4d后质膜H+-ATPase过量表达植株(△GHA2-3)及14-3-3过量表达植株(S23)硝态氮吸收量均高于WT和抑制表达植株,这表明质膜H+-ATPase和14-3-3蛋白参与硝态氮的吸收。用200μmol铝处理WT和这四种转基因植株,发现铝胁迫下过表达转基因植株质膜H+-ATPase、氢泵活性及14-3-3与质膜H+-ATPase互作水平均高于WT,这表明14-3-3与质膜H+-ATPase通过蛋白互作提高了质膜H+-ATPase活性及氢泵活性从而提高了植物对硝态氮的吸收能力。本研究结果表明POD转基因能够通过提高POD酶活性和降低植株体内H2O2含量,提高氢泵活性、质膜H+-ATPase活性及其与14-3-3蛋白互作水平来促进烟草柠蒙酸分泌以提高烟草耐铝性。铝胁迫通过影响氢泵活性、质膜H+-ATPase活性及其与14-3-3蛋白互作水平影响植物对硝态的吸收。