研究背景和目的:肺癌是近年来发病率和死亡率呈不断上升趋势的恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康。分子生物学和免疫学研究表明,肺癌的发生发展是一个多因素、多阶段与多基因变异积累的复杂的病理演变过程。虽然随着对肿瘤性疾病的深入研究,肺癌的治疗方法和策略较以前已有很大进步,但是患者的5年生存率仍低于15%。因此深入研究肺癌的发病机制,是防治肺癌的迫切需要。ABCG2基因（ATP-binding cassette super—family G member 2）是ABC转运体家族的成员之一,参与肿瘤的多药耐药（multidrug resistance,MDR）。因其首先在乳腺癌细胞中被发现,所以其编码的蛋白又叫乳腺癌耐药蛋白（breast cancerresistance protein BCRP）。随着研究的深入,人们发现ABCG2基因与干细胞有着某种联系,并认为其是一种潜在的干细胞标记。对ABCG2蛋白在肺癌组织和肺癌细胞中的分布研究结果表明,ABCG2的表达不符合干细胞的分布特点和规律,ABCG2单独不适于作为肺癌干细胞的标志。目前,对ABCG2的研究主要集中在其介导的耐药和与干细胞的联系方面。本课题组在“ABCG2对肺癌细胞生物学行为的影响”的研究中发现,ABCG2基因沉默导致肺癌细胞在体外的生长变缓。有关ABCG2在肿瘤细胞增殖中是否也具有重要作用目前尚不清楚。为进一步确定ABCG2在肺癌细胞增殖中的作用,本研究应用RNA干扰技术（RNAi）在建立ABCG2基因沉默之人肺腺癌细胞GLC-82动物皮下肿瘤模型的基础上,对ABCG2基因沉默对人肺腺癌细胞GLC-82体内增殖的影响进行研究;用形态定量、体视学方法定量分析沉默ABCG2基因后肺癌细胞体内外的形态变化及超微结构特点,为进一步探讨ABCG2对肺癌细胞生物学的影响提供实验依据,为肺癌的防治提供方法和策略。方法:一、沉默ABCG2基因对人肺腺癌细胞GLC-82体内增殖能力的影响1.将本实验室保存的人肺腺癌细胞GLC-82、已建系并鉴定的绿色增强荧光蛋白（EGFP）标记的细胞GLC-82/EGFP⁺及ABCG2基因沉默的细胞GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-分别接种于裸鼠皮下,观察细胞成瘤能力的变化,绘制体内生长曲线。2.流式细胞术检测瘤组织中瘤细胞的周期分布。3.应用免疫组化（SP法）观察裸鼠皮下瘤组织中Ki-67、ABCG2、Bcl-2、p53的表达,并用图像分析系统对ABCG2蛋白在瘤细胞中的表达进行定量分析,测试其表达的阳性单位。4.采用Ploton法对瘤组织进行核仁组成区嗜银蛋白（AgNORs）染色,用图像分析系统测试平面上肿瘤细胞核内AgNORs颗粒数、单个AgNORs颗粒面积、单个核AgNORs总面积,并根据标准化方案对AgNORs进行形态学分型。二、沉默ABCG2基因对人肺腺癌细胞GLC-82细胞形态的影响1.观察GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-、GLC-82/EGFP⁺、GLC-82细胞体内体外形态,体外细胞培养爬片后行HE染色和细胞骨架蛋白染色。2.用图像分析系统测试沉默ABCG2基因后GLC-82细胞爬片及瘤组织切片下细胞的几何形态学参数。选取的形态学参数包括细胞与核的面积（A_c,A_n）、细胞与核的周长（C_c,C_n）、细胞与核的长轴(d_maj,c,d_maj,n)、细胞与核的短轴(d_min,c,d_min,n)、轴比（Ra_c,Ra_n）、胞浆面积（Acp）、核浆比（Rnp）、细胞与核的形状因子PE（PE_c,PE_n）、细胞与核的形状因子AR（AR_c,AR_n）、细胞与核的规划形状因子RFF（RFF_c,RFF_n）以及细胞与核形状不规则指数FⅡ（FⅡ_c,FⅡ_n）。3.裸鼠皮下瘤组织常规电镜制样、半薄切片定位后行超薄切片,应用图像分析系统对瘤细胞的细胞核、线粒体、内质网进行体视学定量分析。选用的体视学参数有体积密度（V_v）、表面积密度（S_v）、数密度（N_v）、平均体积（v）、平均表面积（s）、平均自由程（λ）、表面积与体积比（Rsv）,此外还有核浆比（Rnp）。结果:一、沉默ABCG2基因对人肺腺癌细胞GLC-82体内增殖能力的影响1.GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞与GLC-82/EGFP⁺、GLC-82细胞相比,裸鼠皮下成瘤能力降低,表现为GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞生长滞后且其成瘤组织的体积均小于GLC-82/EGFP⁺和GLC-82,差异有显著性（P＜0.001）。2.流式细胞术检测瘤组织中瘤细胞的周期发现:GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-、GLC-82/EGFP⁺、GLC-82细胞的S期细胞比例两两比较无显著性差异（P=0.556）,ABCG2基因沉默后,细胞周期中S期的比例明显减少,而G1期细胞比例明显增多,差异具有显著性（P＜0.001）。3.免疫组化检测:裸鼠体内GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞成瘤组织中ABCG2蛋白的表达明显减弱,其阳性单位小于GLC-82、GLC-82/EGFP⁺细胞成瘤组织,差异具有显著性（P＜0.001）。Ki-67增殖指数（PI）在GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞成瘤组织中的表达较GLC-82组、GLC-82/EGFP⁺组明显降低（P＜0.001）;Bcl-2在3组细胞的成瘤组织中均不表达,p53在3组中均有少量表达,但差异无显著性意义。4.AgNORs图像分析结果显示,GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞中AgNORs的颗粒数、单个核内AgNORs总面积减少,而单个AgNORs颗粒面积增大,差异具有显著性（P＜0.001）。对AgNORs的形态分型结果表明,GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组瘤组织细胞中AgNORs颗粒主要为混合型,而GLC-82/EGFP⁺组、GLC-82组AgNORs颗粒主要为弥散型,差异具有显著性（P＜0.001）。二、沉默ABCG2基因对人肺腺癌细胞GLC-82细胞形态的影响1.GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞体外培养呈梭形,GLC-82/EGFP⁺细胞、GLC-82细胞呈圆形、椭圆形或多角形。2.细胞骨架蛋白染色结果显示:GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞中细胞骨架纤细,延伸于整个胞浆,GLC-82/EGFP⁺细胞、GLC-82细胞较粗,浓集于细胞核周围。3.图像定量分析HE爬片的细胞平面形态学参数发现GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞与GLC-82/EGFP⁺细胞、GLC-82细胞相比,d_maj,c、C_c、Ra_c、d_maj,n、Ra_n、Ac、Acp、FII_c、FII_n增大,PE_c、AR_c、RFF_c、PE_n、AR_n、RFF_n、R_np减小,差异具有显著性（P＜0.001）。4.瘤组织HE切片镜下观察发现,GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组细胞胞体增大、胞浆空亮,AB-PAS染色呈阴性,证明空亮的胞浆中所含物质非粘液;此外细胞核大小悬殊,核形不规则。5.图像定量分析显示GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组细胞与GLC-82/EGFP⁺组、GLC-82组相比,FII_n、A_c、A_cp增大,PE_n、AR_n、RFF_n、R_np减小,差异具有显著性（P＜0.001）。6.电镜下观察细胞超微结构发现,肿瘤细胞细胞核异型性明显,胞浆内可见线粒体及大量溶酶体,GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组细胞内的线粒体空泡化明显,较多扩张的内质网,并可见胞浆内特征性的“蛋白池”（由蛋白样分泌物形成的“池”状结构）。7.对瘤细胞的细胞核、线粒体、内质网的体视学定量分析,结果显示GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组细胞核的V_v、S_v、R_np小于GLC-82/EGFP⁺组,λ大于GLC-82/EGFP⁺组,差异具有显著性（P＜0.001）;GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组细胞线粒体的V_v、S_v大于GLC-82/EGFP⁺组,九小于GLC-82/EGFP⁺组,差异具有显著性（P＜0.001）;GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组细胞线粒体的N_v、v、s虽然大于GLC-82/EGFP⁺组,但差异尚未显示出显著性（P＞0.05）。GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组内质网的V_v大于GLC-82/EGFP⁺组,R_sv小于GLC-82/EGFP⁺组,差异具有显著性（P＜0.001）。结论:1.沉默ABCG2基因能使GLC-82细胞在裸鼠皮下成瘤能力明显降低,表明ABCG2基因对GLC-82细胞的体内增殖具有重要作用,可作为人肺腺癌细胞的治疗靶点加以研究;2.GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-组成瘤组织癌细胞Ki-67增殖指数下降;瘤组织癌细胞大部分被抑制在G1期;AgNORs的颗粒数及单个核内AgNORs总面积减少,而单个AgNORs颗粒面积增大,且AgNORs主要为混合型,而沉默对照组（GLC-82/EGFP⁺组）和空白对照组（GLC-82组）AgNORs主要为弥散型。3.沉默ABCG2基因后的GLC-82/EGFP⁺/ABCG2^-细胞形态结构发生改变:体外培养细胞呈梭形;瘤细胞在体内表现为细胞体积增大,核形不规则（其核体积密度、表面积密度及核浆比减少）,线粒体肿胀（其体积密度、表面积增大、平均自由程变小）,内质网扩张（其体积密度增大、表面积与体积比减少）,胞浆内“蛋白池”形成;光镜下表现为胞体增大,胞浆空亮,核形不规则。