肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)是由Carswell等人发现的一种能够杀伤肿瘤细胞的炎性细胞因子。其由自然杀伤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等产生,具有促进细胞增殖和分化、杀伤或抑制肿瘤细胞、调节机体免疫等多种生物功能,不仅能帮助机体抵抗如大肠杆菌、结核分枝杆菌等病原微生物的感染,还能与其它细胞因子一起参与机体自身免疫性疾病的发生和发展。TNF-α作为一种评价牛结核病、牛乳房炎等牛疾病的重要指标,具有重要的应用价值和临床意义。本研究旨在制备出基于流式细胞术检测牛胞内TNF-α的单克隆抗体,为诊断相关牛疾病提供原材料。1.牛TNF-α基因的克隆及原核表达分离荷斯坦奶牛外周血单个核细胞(PBMC),加入佛波酯(PMA)刺激6h后提取细胞总RNA并反转录成cDNA,以cDNA为模板扩增目的基因BoTNF-α,将扩增成功的目的基因连入原核表达载体pET-30a(+)和pGEX-6p-1中构建重组表达质粒。经过PCR、酶切、测序验证正确后,将两种载体分别导入宿主表达菌BL21(DE3)及BL21中,构建重组表达菌 BL21(DE3)(pET-30a(+)-BoTNF-α)和 BL21(pGEX-6p-1-BoTNF-α)。加入 IPTG 诱导表达后,经SDS-PAGE验证两种重组蛋白条带大小分别为23.4kDa和43.4kDa。Western blot结果显示两种重组蛋白均具有良好的免疫反应性。2.牛TNF-α单克隆抗体的制备及初步应用以融合蛋白rHis-BoTNF-α免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠,三次免疫后,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。以融合蛋白rGST-BoTNF-α作为检测抗原筛选阳性细胞,经多次筛选及亚克隆,共获得16株能稳定分泌BoTNF-α单克隆抗体的细胞株,分别命名为 1A1、1A2、1A5、1B8、1D3、2B10、2H9、2H11、3C1、3C6、3D6、3E1、3G11、4B12、4G4 和 5F3。经小鼠单克隆抗体亚类分型鉴定:1A1和3E1两株单克隆抗体亚类为IgA型,1A2为IgG2a 型,1A5、1B8、2H9、3C6、3D6、3G11、4G4 的亚类为 IgG2b 型,其余亚类均为IgG1型。采用间接ELISA法测定单抗细胞上清和腹水效价,除1A1、3E1、2B10、2H11的腹水效价及1A1、3E1细胞上清效价较低外,其余单抗的上清效价均在1:1.0×104以上,腹水效价均在1:1.0×107以上。ELISA结果表明16株单抗与商品化大肠杆菌表达的重组BoTNF-α蛋白均具有良好的反应性。单抗特异性鉴定结果发现,所获得的16株单抗均不与牛IFN-γ、牛IL-2有反应性,其中1A1、1B8、1D3、2B10、2H9、4G4也不与人TNF-α、鼠TNF-α、猪TNF-α和羊TNF-α蛋白有交叉反应性,说明这6株单克隆抗体有良好的特异性。1A2、1A5、2H11、3C1、3E1 与羊 TNF-α 有交叉反应,3C6、3D6、3G11、4B12与猪TNF-α、羊TNF-α、人TNF-α有交叉反应,5F3与人TNF-α、鼠TNF-α、猪TNF-α、羊TNF-α蛋白都有交叉反应。Western blot结果显示16株抗体均与融合蛋白rHis-BoTNF-α和rGST-BoTNF-α有良好的免疫反应性。间接免疫荧光结果显示1A2、1A5、1B8、2H9、3C1、3D6、4B12、4G4和5F3能够很好的识别真核表达的BoTNF-α。流式细胞术检测结果显示1A2、1A5、2H9、2H11、3C1和4G4这7株单克隆抗体能够很好的识别天然BoTNF-α。通过对流式细胞术刺激剂、刺激剂浓度和抗体使用浓度的摸索,成功建立了流式细胞术检测方法,最终确立了最适刺激剂为50 ng/ml PMA联合1 μg/ml离子霉素,抗体3Cl-FITC最佳使用浓度为1.25 μg/ml。使用耻垢分枝杆菌感染牛PBMCs后,与未感染组相比,感染组TNF-α有明显的上升。分离牛结核阳性牛和牛结核阴性牛的PBMCs,经特异性抗原CFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激后,使用建立的流式检测方法进行检测。结果显示基于单抗3C1-FITC的流式细胞术检测方法能够很好的应用于BoTNF-α的检测。