金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌噬菌体的分离、鉴定及其在细菌检测中的应用

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随着细菌耐药性问题的日趋严重,噬菌体作为一种新型抗菌剂重新得到人们的关注。噬菌体有着不同于抗生素的杀菌机制并具有诸多优势,如自然界中存在极广、杀菌特异和与宿主共进化不易产生抗性等。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌能引起多种感染性疾病,是常见病原微生物,威胁着全球公共健康并对医疗系统造成沉重的负担。  本课题分为两个部分:第一部分以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为研究对象,从自然界的水体和土壤中筛选烈性噬菌体并对噬菌体进行表征。第二部分是以金黄色葡萄球菌为研究对象,以噬菌体作为识别元件,利用修饰了噬菌体的磁珠捕获金黄色葡萄球菌,发展了一种便于携带和现场检测的金黄色葡萄球菌检测方法。该方法具有高灵敏性和特异性、所需样品少、成本效益高、检测时间短等优点。  第一部分:从采集的水样和土样中分离得到噬菌体16株,其中铜绿假单胞菌噬菌体10株,金黄色葡萄球菌噬菌体6株。对分离得到的噬菌体纯化后进行了最佳感染复数和宿主谱的测定。通过氯化铯密度梯度离心得到纯净的噬菌体颗粒,利用透射电子显微镜(TEM)对其进行形态学表征。结果表明,分离得到的绝大多数噬菌体都属于有尾噬菌体家族。其中一株金黄色葡萄球菌噬菌体具有较宽的宿主谱(能裂解测试的18株金黄色葡萄球菌临床菌株),而且结合噬菌体高度稳定性、微小体型、与其宿主菌共同进化、高特异性以及能区分活菌和死菌等优点,考虑将其作为金黄色葡萄球菌检测系统的识别元件。  第二部分:将噬菌体共价修饰在磁珠表面,噬菌体特异性捕获样本中的金黄色葡萄球菌。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的任一抗体Fc端与金黄色葡萄球菌表面蛋白A(SPA)特异性结合的特性,形成磁珠-噬菌体-金黄色葡萄球菌-IgG-HRP的复合体。最后通过辣根过氧化物酶催化TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺)底物显色完成对金黄色葡萄球菌的检测。整个检测可在90min内完成,在PBS中检测金黄色葡萄球菌的线性检测范围为1.0×104到1.0×106CFU/mL,检测限为2.47×103CFU/mL。该体系成功用于苹果汁模拟样本中的金葡菌检测,其线性检测范围为1.0×104到1.0×106CFU/mL,检测限为8.86×103CFU/mL。在重复性实验中,相对标准偏差为3.65%,说明本检测体系具有良好的重现性。该体系对于除了金黄色葡萄球菌以外的所有菌株都无响应信号,显示出良好的特异性。本部分构建的检测体系使用噬菌体磁分离技术(Phagomaganetic separation,PMS),把噬菌体的优点和磁珠的操作简便快速相结合,实现对金黄色葡萄球菌的高效检测。此外,常规的基于抗体的金黄色葡萄球菌检测体系中,由于链球菌表面蛋白质G和抗体能非特异性结合,从而造成“假阳性”,本体系解决了该问题。本方法耗时短、灵敏度高、特异性优异和成本效益高,在食品安全和控制领域具有很好的应用价值和潜能。
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