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末端锚定蛋白(TA蛋白)是一类独特的膜整合蛋白,存在于所有生物中。此类蛋白通过位于C端的唯一疏水跨膜结构域锚定在多种细胞器膜上,参与胞内很多重要的生理生化反应,包括氧化还原、蛋白质转运、信号转导、囊泡运输及细胞凋亡等。前人研究表明,在哺乳动物和酵母中,TA蛋白插入到内质网膜是由TRC复合物介导完成的。但是,植物中TA蛋白定位到内质网的机制尚不清楚。 利用生物信息学方法发现,拟南芥中包括3个TRC40/Asna1/Get3的同源蛋白,分别命名为AtTRC1、AtTRC2和AtTRC3,以及1个TRC受体类蛋白,命名为AtTRCR。首先,对AtTRC1、AtTRC2和AtTRC3的定位进行了预测和分析。结果表明,AtTRC2和AtTRC3蛋白的N端带有特定的信号肽,分别定位在叶绿体和线粒体上;而AtTRC1蛋白没有特定的定位信号和序列,存在于胞质中。其次,对AtTRCR跨膜结构的预测分析表明,与哺乳动物和酵母中的同源蛋白类似,AtTRCR也含有3个跨膜区域,有可能定位于内质网膜。 其次,利用RT-PCR方法从拟南芥幼苗中克隆得到AtTRC1、AtTRC2以及AtTRC3。通过半定量PCR方法,分析AtTRCs在拟南芥不同组织中的表达模式。结果表明,AtTRC1在所有组织中都有表达,特别是在根、叶、花、幼苗和受精后1-3天的荚果中高表达;AtTRC2在花和成熟的荚果中特异高表达;AtTRC3在不同组织中表达相对AtTRC1低的多,除了花和幼嫩的荚果有较高的表达外,其他组织均只有微弱的表达。将AtTRCs与GFP相连接,转化拟南芥叶肉原生质体后观察到,AtTRC1定位于细胞质中;AtTRC2成点状分布,定位于叶绿体;而AtTRC3呈片状,定位于胞质内某种细胞器上。这些结果与预测的定位分析结果基本一致。同时克隆了AtTRC1基因的启动子,转PAtTRC1::GUS植株的GUS染色结果表明,AtTRC1主要在叶片维管组织、花瓣和幼嫩的荚果中表达。这与AtTRC1的表达模式基本一致。利用基因组PCR方法,鉴定出attrc1的纯合突变体。对attrc1突变体生长发育的表型观察发现,在种子萌发和营养生长时期,野生型和突变体没有明显差异。然而,拟南芥开花后发现,attrc1植株矮小,分枝数增多和荚果发育受损。 另外,还从拟南芥幼苗中克隆了AtTRCR基因。其在不同发育时间及不同组织中的基因表达模式与AtTRC1基本一致,而且突变体attrcr表型也与attrc1非常相似。这一结果暗示,AtTRC1和AtTRCR可能共同参与了植物TA蛋白的定位。通过酵母双杂交技术,进一步证明,AtTRC1和AtTRCR确实存在相互作用。 综上推测,与哺乳动物和酵母相似,在高等植物拟南芥中也存在TA蛋白由AtTRC1和受体AtTRCR共同介导插入内质网膜的蛋白定位机制。