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通过LA-PCR方法,从扩展青霉PF898基因组DNA中扩增得到2000 bp的碱性脂肪酶基因5端侧翼区域的单一产物,并进行序列测定及提交GenBank数据库。该序列分别有类似于TATA盒、CAAT盒、GC盒等元件,这些元件均是真核启动子序列的基本结构特征。
对该碱性脂肪酶基因5端侧翼区域进行片段缺失扩增,得到系列亚克隆片段,连接到以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的pGlow-TOPO质粒中,构建了系列重组表达质粒,并成功转化大肠杆菌Ecoil TOP10。荧光显微观察表明阳性转化子均发出绿色荧光,它们启动绿色荧光蛋白表达的功能得到确认。
进一步将脂肪酶基因5端侧翼区域的系列亚克隆片段定向连接到启动子探针型载体pSUPV4中,构建能在大肠杆菌Ecoil DH5a中启动卡那抗性基因表达的重组质粒。结果表明阳性克隆子均赋予大肠杆菌卡那抗性,但抗性的强度不同,卡那霉素抗性水平最高表现为 3500μg/mL,最低表现为1000μg/mL。这些结果充分说明了不同的启动子片段对卡那抗性基因的启动表达能力不同。这些结果与启动GFP报告基因表达的结果相吻合,9个亚克隆片段启动子的功能得到最终确认。