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背景木聚糖酶(Xylanase)是木聚糖降解酶系中最关键的酶,在造纸、食品、饲料、纺织、医药和能源等领域应用广泛。运用现代生物技术手段生产廉价高效的木聚糖酶产品已成为各个行业发展的迫切需要。目的1.克隆黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S菌株来源的木聚糖酶基因,对其进行生物信息学分析；2.构建大肠杆菌工程菌,优化其产木聚糖酶发酵条件；3.纯化重组木聚糖酶,测定其酶学性质,为木聚糖酶的分子改造提供理论依据。方法1.利用分子生物学和基因工程技术从黑曲霉XZ-3S基因组中克隆木聚糖酶基因。2.核苷酸的分析、序列的同源性比较以及进化树的分析利用DNAMAN6.0软件处理；通过http://www.expasy.org/tools/网站进行氨基酸序列分析、二级结构预测及三维结构的同源建模。3.木聚糖酶基因的成熟肽编码区PCR产物与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒,转化E. coli BL21(DE3),获得工程菌。4.采用单因素试验及正交试验,分别从诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度等方面进行发酵条件优化。5.采用镍柱亲和层析纯化重组木聚糖酶,并对该重组酶的最适作用温度、温度稳定性、最适pH、pH稳定性和金属离子对酶作用的影响进行研究。结果1.成功从黑曲霉基因组中扩增得到3种木聚糖酶基因,Genbank登录号分别为：JQ700381(xynZF-1)、JQ700382(xynZF-2)、JQ700383(xynZF-3)。2.序列分析显示：xyn-ZF-1开放阅读框633bp,编码信号肽27个氨基酸,成熟肽184个氨基酸；xynZF-2开放阅读框675bp,编码信号肽18个氨基酸,成熟肽207氨基酸；xynZF-3开放阅读框954bp,编码信号肽19个氨基酸,成熟肽299个氨基酸。3种木聚糖酶均由α-螺旋,β-折叠和少量转角构成；xyn ZF-1和xynZF-2属于GH11超家族,具有典型的“右手半握状”空间结构,而xynZF-3则具有一个5-β-螺旋空间结构,属于GH43超家族。3.成功构建3种木聚糖酶工程菌BL21/xynZF-1、BL21/xynZF-2及BL21/xynZF-3,均检测到木聚糖酶活性。4.通过单因素试验和正交试验得到工程菌产木聚糖酶最佳优化方案：xynZF-1最优发酵条件为：诱导剂浓度0.95mmol/L,诱导时机1.5h,诱导时间1h,诱导温度为31℃; xynZF-2最优发酵条件为：诱导剂浓度2.5mmol/L,诱导时机2h,诱导时间2h,诱导温度31℃; xynZF-3最优发酵条件为：诱导剂浓度1.5mmol/L,诱导时机2h,诱导时间2.5h,诱导温度25℃。5.通过镍柱亲和层析方法成功获得电泳纯级重组木聚糖酶。酶学性质如下：xynZF-1最适温度和pH是45℃和4.6, Fe3+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、Ni2+对该酶具有明显的抑制作用,而Ca2+有一定的促进作用；xynZF-2最适温度和pH是40℃和5.0,Fe2+、Cu2+、Mg2+、Pb2+、Li+、Ca2+对该酶有一定的抑制作用,而Zn2+、Fe3+、Mn2+、 Ni2+、EDTA有一定的促进作用；xynZF-3最适温度和pH是45℃和5.0,Fe2+、Mn2+、 Pb2+、Li2+、Ni2+对该酶有明显的抑制作用,Fe3+具有明显的促进作用。这3种重组木聚糖酶在40℃和pH5.0,均有良好的稳定性,而xynZF-3稳定性最高；xynZF-1、xynZF-3在酸性环境中稳定性较好,xynZF-3在pH5-9之间具有良好的稳定性。结论本研究首次从黑曲霉XZ-3S菌株中克隆出3种木聚糖酶基因,并对其进行生物信息学分析、大肠杆菌的异源表达、工程菌发酵条件的优化、重组木聚糖酶的纯化及酶学性质的测定,从而丰富了木聚糖酶的种类和数量,为木聚糖酶基因的真核表达和酶分子结构改造奠定了基础,以期为该酶的工业化生产和应用提供理论依据和保障。