第一部分促心肌分化基因筛选目的：对SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、 SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四个亚群基因芯片结果通过Real-timePCR筛选出在SCA-1+CD45+CD31+亚群表达最高的基因方法：根据基因芯片结果筛选出在SCA-1+CD45+CD31+亚群表达量最高的基因，包括myl3、Itga4、Epor、Rock2、Cxadr、设计引物。提取SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四组亚群细胞及未分选群细胞的RNA，逆转录成cDNA，进行Real-timePCR检测各基因在四组亚群及未分选群细胞中的表达量。结果：经Real-timePCR检测， Itga4在未分选组中表达最高、 Epor在SCA-1+CD45-CD31+亚群中表达最高、Rock2在SCA-1+CD45-CD31-亚群中表达最高、Cxadr在SCA-1+CD45-CD31-亚群中表达最高，myl3在SCA-1+CD45+CD31+亚群中表达最高，且与其他亚群及未分选群比较有统计学差异（P<0.05）。结论：myl3在SCA-1+CD45+CD31+亚群中表达量明显高于其他三个亚群及未分选群。myl3为肌球蛋白轻链家族中一员，是肌小节粗肌丝的组成部分，属于碱性轻链慢肌/心室肌型，目前研究表明其在肌肉再生，促进肌肉收缩方面有重要作用，而目前尚未有研究其在促进心肌分化方面的作用。第二部分小鼠心梗模型的建立目的：开胸直视下结扎小鼠冠状动脉前降支，成功建立小鼠心肌梗死模型，进行体内实验。方法：24只雄性C57BL/6小鼠，体重在14-22g，分为心梗组（n=12），假开胸组（n=12），常规麻醉，固定小鼠，气管切开插管，开胸，找到前降支，结扎，心梗建立成功，逐层关胸后拔气管插管。比较结扎前后心电图，心超及组织学变化。结果：结扎后心电图导联ST段明显抬高，>0.2mv，术后四周心超提示心梗组EF和FS值较假开胸组明显下降（P<0.05）,左室舒张末期内径和左室收缩末期内径明显增加（P<0.05），心脏HE染色证实建模成功。结论：气管插管开胸直视下行小鼠冠状动脉前降支结扎术成功建立小鼠心梗模型。第三部分myl3促进小鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的体外研究第一节小鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定目的：从小鼠骨髓中分离出有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(Bone MesenchymalStem Cells，BMSCs)。为进一步的实验研究提供可靠的细胞。方法：小鼠全骨髓培养。流式鉴定细胞表面抗原表达。结果：体外培养的原代MSCs10～14d达到融合，结果显示超过90％小鼠骨髓间充质干细胞性表达CD29（细胞整合素分子）、CD90（粘附分子）和CD44（粘附分子，介导细胞对透明质酸和骨桥蛋白的粘附）；但不表达造血祖细胞表面标志CD11b、CD133。结论：利用MSCs贴壁特性，在体外条件下成功分离、培养和扩增了小鼠骨髓间充质干细胞，用于下面体内体外研究。第二节转染myl3-siRNA检测心肌特异性因子表达目的：将合成的myl3-siRNA转染进小鼠骨髓间充质干细胞，并检测转染后的心肌特异性因子的表达。方法：利用lipofactaminTM2000转染试剂将合成好的myl3-siRNA转染进小鼠骨髓间充质干细胞作为实验组（A组），另将空白载体的siRNA转进小鼠骨髓间充质干细胞作为对照组（B组），24h倒置荧光显微镜下观察GFP表达检测转染效率。并用心肌细胞裂解液诱导A组和B组向心肌样细胞分化。48小时后收集细胞，设计myl3引物，Real-time PCR检测其表达量。设计GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin引物，Real-timePCR检测心肌特异性因子在转染后的表达。结果：转染效率达60%以上。Real-time PCR检测myl3表达量较对照组明显下降。进一步检测心肌特异性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin，与对照组比均下降。结论：成功构建myl3-siRNA，转染骨髓间充质干细胞后能下调心肌特异性因子。第三节构建过表达myl3质粒目的：构建myl3过表达质粒，并对构建好的质粒进行测序鉴定。方法：从含有目的基因的质粒克隆模板中，利用PCR方法钓取目的基因，若没有模板则利用全基因合成的方法得到目的基因。将目的基因与目的载体分别进行酶切。纯化酶切产物后进行连接，将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行酶切鉴定，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对阳性克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的目的基因表达质粒载体。将构建好的过表达质粒载体进行超纯去内毒素抽提。结果：双酶切鉴定及测序结果证实过表达myl3质粒构建成功。结论：成功的合成了myl3过表达质粒，用于该基因的功能研究。第四节转染过表达myl3质粒检测心肌特异性因子表达目的：将构建好的过表达myl3的质粒转入小鼠骨髓间充质干细胞，并检测转染后的心肌特异性因子的表达。方法：利用lipofactaminTM2000转染试剂将合成好的过表达myl3的质粒转染进小鼠骨髓间充质干细胞作为实验组（A组），并用同样的方法将空白质粒转进小鼠骨髓间充质干细胞作为对照组（B组），小鼠骨髓间充质干细胞作为空白组（C组）。24h倒置荧光显微镜下观察GFP表达检测转染效率。48小时后收集细胞，设计myl3引物，Real-time PCR检测其表达量。用5-氮胞苷（10umol/L）对A组、B组细胞进行诱导，C组不进行诱导，两周后抽取RNA，行Real-time PCR检测GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT的表达量。制备小鼠心肌细胞裂解液，对另一批A组、B组细胞进行诱导，两周后抽取RNA，行Real-time PCR检测GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin的表达量。结果：转染效率同样在60%以上。Real-time PCR检测myl3表达量较对照组明显升高，经5-氮胞苷诱导后转染了过表达myl3质粒的小鼠骨髓间充质干细胞（A组）其心肌特异性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5的表达量较转染空白质粒的骨髓间充质干细胞（B组）升高，而A组和B组细胞较C组比较上述心肌特异性因子的表达下降，而cTnT表达量在A组明显高于B组和C组。重复上述实验，结果同前。检测经心肌细胞裂解液诱导后的A、B、C组细胞心肌特异性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT的表达量，我们发现A组>B组>C组，重复实验结果同前。我们将经心肌细胞裂解液诱导后多检测的A、B、C组细胞各心肌特异性因子的表达量进行统计学分析，A组的心肌特异性因子的表达较B组高且有统计学差异（P<0.05），B组高于C组且有统计学差异（P<0.05）。进一步行免疫荧光检测。结论：myl3过表达后经心肌细胞裂解液诱导，能促进小鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。第五节心肌特异性因子的免疫荧光检测目的：从蛋白水平上进一步验证过表达myl3基因后小鼠骨髓间充质干细胞心肌分化的能力方法：利用lipofactaminTM2000转染试剂将合成好的过表达myl3的质粒转染进小鼠骨髓间充质干细胞作为实验组（A组），并用同样的方法将空白质粒转进小鼠骨髓间充质干细胞作为对照组（B组），制备小鼠心肌细胞裂解液，加入转染后的骨髓间充质干细胞的条件培养液中，诱导向心肌细胞分化，两周后行免疫荧光检测。结果：经心肌细胞裂解液诱导14天后，过表达myl3的骨髓间充质干细胞表达更多的心肌特异性因子Cx43，Desmin（图中发红光）。而转染空白载体的骨髓间充质干细胞其心肌特异性因子Cx43，Desmin表达量明显减少。结论：从蛋白水平进一步证实myl3过表达后能更好促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。第四部分myl3促进小鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的体内研究目的：研究过表达myl3基因的小鼠骨髓间充质干细胞在心梗的小鼠模型中是否能促进其向心肌样细胞分化，并改善心功能。方法：选用雄性C57BL/6小鼠24只，体重在14-20g，气管插管开胸直视下行冠状动脉前降支结扎术，建立小鼠心梗模型。小鼠随机分为四组：转染过表达myl3的BMSC组（A组，n=6只），转染空白载体组（B组，n=6只），BMSC组（C组，n=6只），PBS组（D组，n=6只）。将四组细胞分别注射进小鼠心梗及周边区域，手术当天及四周后分别检测心超，评估心功能，四周后处死小鼠，取心脏组织行组织学检测。结果：小鼠骨髓间充质干细胞移植四周后，进行心超检测，A组EF值较B、C、D组升高，但无统计学差异，（P>0.05）,但比较BMSC移植前后EF值的差值，我们发现A组较其他各组明显升高且有统计学差异（P<0.05）。FS在注射干细胞前后的差值也在A组最高，且与其他三组比较有统计学差异（P<0.05），A组的左室收缩末期容积和左室舒张末期容积在干细胞注射前后的差值也是最高，且有统计学差异（P<0.05）。心脏Masson染色测量心梗面积，提示A组心梗面积最小，纤维化程度最轻，且有统计学差异（P<0.05）。行心脏特异性抗原Cx43、desmin免疫组化检测，两种抗原在A组小鼠心脏中表达明显，进一步行免疫荧光检测，过表达myl3的BMSC两组抗原表达也很明显。结论：体内实验我们发现将myl3基因过表达后能明显改善小鼠心梗后的心功能，减小心梗面积，免疫组化及免疫荧光进一步证实myl3能更好促进BMSC向心肌样细胞分化。