论文部分内容阅读
研究目的:神经病理性疼痛（neuropathic pain,NP）的患病率呈逐年增多的趋势,miRNAs因其高稳定性和进化保守性,有望成为潜在的治疗靶点,运动训练作为一种非药物干预措施是治疗神经病理性疼痛的重要研究方向,但其机制尚不明确。基于此,本文研究目的:1.探索miRNAs及其下游基因在NP中的作用;2.检测周围神经损伤所致神经病理性疼痛小鼠背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）中转录组变化,对比差异表达基因,明确参与神经病理性疼痛的关键miRNAs和m RNAs;3.阐明运动训练对SNI小鼠DRGs中miR-183家族及其靶基因的表达、疼痛行为的影响;4.验证运动训练是否通过miR-183/Cacna2d1-2途径达到改善神经病理性疼痛的作用。研究方法:本文一共四部分,研究一中,对Pub Med、Embase、Web of Science和CINAHL Complete（EBSCO）四个数据库进行系统检索。纳入探讨miRNAs在NP中的作用的实验性研究和基因表达谱（转录组测序）研究,提取miRNAs相关的细节内容,利用Target Scan、Funrich、Cytoscape和String数据库确定这些miRNAs的预测靶基因并进行生物信息学分析。研究二,将12只C57BL/6成年雄性小鼠随机分为SNI组和假手术组（sham组）,构建坐骨神经分支选择性损伤（spared nerve injury,SNI）小鼠模型,术前1天、术后3天、7天、14天、21天、28天、35天和42天进行机械性刺激缩足阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）测试评估疼痛行为学表现,6周后取造模侧坐骨神经和L4-L6 DRGs。对坐骨神经进行HE染色,观察组织形态变化;对DRGs提取总RNA,进行转录组测序,分析差异表达基因,然后对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,结合研究一结果,确定差异表达的关键m RNA。研究三,将成年C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组（na（?）ve组）、假手术组（sham组）、假手术+运动组（sham+swim组）、SNI组和SNI+运动组（SNI+swim组）,每组15只。运动组进行6周水中运动干预,其余组常规饲养。在术前和术后进行MWT测试,时间点同研究二。HE染色观察造模侧L4-L6 DRGs和坐骨神经形态变化,免疫荧光染色观察各组Cacan2d1和Cacna2d2在DRGs中的定位与表达变化,q RT-PCR和WB检测miR-183家族（miR-183/182/96）和Cacan2d1/2的m RNA和蛋白表达水平情况。研究四,通过miRNA靶基因预测数据库Targetscan和RNAhybrid 2.2分别预测miR-183和Cacna2d1/2的结合位点。然后进行细胞实验,通过双荧光素酶报告基因验证miR-183和Cacna2d1、miR-183和Cacna2d2的靶向关系。接着构建miR-183敲除（knock-out,KO）小鼠模型,分为敲除+运动组（miR-183 KO+swim组）、敲除组（miR-183 KO组）、正常组（na（?）ve组）和正常+运动组（na（?）ve+swim组）。运动组进行6周水中运动干预,其余组常规饲养。在干预前和干预后进行MWT测试。q RT-PCR和WB检测miR-183家族（miR-183/182/96）和Cacan2d1/2的m RNA和蛋白表达水平情况。研究结果:研究一,一共纳入133篇文献,其中23篇是miRNA测序类研究,113篇是miRNA的实验验证性研究（有3篇二者兼顾）。113篇实验性研究验证了91个可能参与NP调控的miRNAs。其中,有96篇文献采用NP手术模型,验证了79个miRNAs。在NP手术模型中,miR-96、miR-182、miR-183、miR-30b和miR-145在脊髓和DRG中均下调,且至少有两项实验研究报道了这5种miRNAs在NP中的作用。通过miRNA调控网络分析,发现多个miRNAs靶向瞬时受体电位通道、电压门控钠通道和电压门控钙通道。研究二,从术后3天起,SNI小鼠损伤侧机械性刺激缩足阈值显著下降（p＜0.001）,且在之后的6周均维持在较低水平。HE染色显示SNI小鼠坐骨神经纤维间隙增大,轴突间隙增大,施万细胞增殖,外周出现炎性浸润。转录组测序结果显示,SNI小鼠DRGs中存在1520个差异表达基因（822个显著上调,698个显著下调）,将这1520个差异表达基因与研究一中经实验验证的NP手术模型中的miRNAs的靶基因取交集,发现存在8个重叠基因,分别是Cacna2d1、Csf1、Socs1、Bdnf、Irak1、Cacna2d2、Kcna2和Akt3。这些差异基因的功能主要与轴突发育（axon development）、轴突生成（axonogenesis）、细胞外基质（extracellular matrix）、轴突部分（axon part）、离子门控通道活性（ion gated channel activity）和粘多糖结合（glycosaminoglycan binding）相关,主要富集在神经活性配体-受体交互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）通路上。研究三,SNI+swim组的术后MWT始终显著低于sham+swim组（术后3、7、14、21、35天:p＜0.001;术后42天:p=0.031）,但是经水中运动干预,SNI+swim组MWT逐渐上升,在术后21天（p=0.046）、28天（p＜0.001）、35天（p＜0.001）和42天（p＜0.001）显著高于SNI组。HE染色显示,相较于SNI组,SNI+swim组坐骨神经神经纤维间隙改善,轴索清晰,施万细胞增殖减少;SNI组DRG神经元呈空泡样变性,胞体内尼氏体数量减少,神经纤维形态不完整,运动后有明显改善。免疫荧光染色显示SNI组Cacna2d1和Cacna2d2在DRG神经元胞体中荧光强度增强,运动后荧光强度减弱。q RT-PCR和WB结果显示,SNI组miR-183、miR-182和miR-96表达均显著降低（p＜0.05）,Canca2d1和Cacna2d2的m RNA和蛋白表达均显著上升（p＜0.001）。水中运动干预6周后,相较于SNI组,SNI+swim组的miR-183/182/96表达均显著升高（p＜0.001）,Canca2d1/2的表达显著降低（p＜0.05）。研究四,双荧光素酶检测结果显示,mmu-miR-183-5p对psi CHECK-Cacna2d1、psi CHECK-Cacna2d1-mut的荧光表达均没有显著抑制作用（p＞0.05）,对psi CHECK-Cacna2d2的荧光表达有显著抑制作用（p＜0.001）;对psi CHECK-Cacna2d2-mut的荧光表达没有显著抑制作用（p＞0.05）。miR-183 KO小鼠在各个时间点的MWT均显著低于na（?）ve组（p＜0.001）,对miR-183 KO小鼠进行水中运动干预,结果发现与naive组相比,miR-183 KO+swim组的MWT始终显著低于naive组（p＜0.001）,但是与miR-183 KO组相比,miR-183 KO+swim组小鼠的MWT逐渐上升,在第21天起,miR-183 KO+swim组小鼠的MWT显著高于miR-183 KO组（p＜0.05）。q RT-PCR结果显示,与na（?）ve组相比,miR-183 KO组Cacna2d1和Cacna2d2 m RNA表达水平均显著上升（p＜0.05）。水中运动干预6周后,miR-183 KO+swim组Cacna2d1和Cacna2d2 m RNA表达水平均显著下降（p＜0.05）。WB结果显示,miR-183 KO组的CACNA2D1和CACNA2D1表达水平显著增加（p=0.035）。水中运动干预6周后,miR-183 KO+swim组CACNA2D1表达水平较miR-183 KO组显著下降,而CACNA2D2无显著性差异（p＞0.05）。研究结论:（1）存在一些miRNAs（miR-200b-3p、miR-96、miR-182、miR-183、miR-30b、miR-155和miR-145）及其靶基因参与已知的神经病理性疼痛相关通路,miRNAs通过靶向电压门控离子通道蛋白（CaVs）可在一定程度上缓解疼痛。（2）SNI小鼠DRGs存在822个m RNAs表达显著上调,698个m RNAs表达显著下调。同时结合研究一,比较分析出多个与之重叠的差异表达基因,分别是Cacna2d1、Csf1、Socs1、Bdnf、Irak1、Cacna2d2、Kcna2和Akt3。其中,Cacna2d1和Cacna2d2同属CaVsα2δ亚基成员。这些差异基因是治疗神经病理性疼痛的潜在靶点。（3）SNI小鼠DRGs中miR-183家族表达显著下降、CaV亚基α2δ-1（Cacna2d1）和α2δ-2（Cacna2d2）m RNA和蛋白表达水平均显著上升。水中运动干预可改善周围神经损伤所致神经病理性疼痛小鼠机械性刺激痛觉超敏,同时逆转了神经损伤导致的miR-183家族的表达抑制与Cacna2d1/2的表达上调。（4）双荧光素酶报告基因显示Cacna2d2是miR-183的靶基因。miR-183 KO可诱发小鼠机械性刺激痛觉超敏,并导致Cacna2d1和Cacna2d2的表达上调。水中运动干预仅在一定程度上缓解miR-183 KO小鼠机械性刺激痛觉超敏,并降低Cacna2d1的表达而非Canca2d2。提示miR-183可通过靶向抑制Cacna2d2参与运动改善机械性刺激痛觉超敏的疗效机制。