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目的:初步探讨 1,25 二羟基维生素 D3(1,25 dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)联合白介素-6(Interleukin 6,IL-6)诱导髓源抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells,MDSC)的生成及其相关机制,通过研究1,25(OH)2D3对MDSC表面分子和功能的影响,阐述1,25(OH)2D3对MDSC的免疫调节作用,为1,25(OH)2D3的临床应用提供新的思路。方法:1.采集健康人的EDTA抗凝血,采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),分别/联合 IL-6、粒单核细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和1,25(OH)2D3刺激健康人外周血单个核细胞,通过流式细胞分析仪检测HLA-DR-lowCD33+CD11b+MDSC的表达频率,比较各刺激组与未处理组的MDSC变化情况。2.通过流式细胞仪检测未处理组、1,25(OH)2D3联合IL-6组、1,25(OH)2D3联合IL-6+JAK抑制剂组PBMC胞内STAT3、STAT5的磷酸化水平。3.利用流式细胞分选仪分选出正常人的CD3+T淋巴细胞、正常人MDSC、1,25(OH)2D3联合IL-6诱导的HLA-DR-lowCD33+CD11b+MDSC。正常人CD3+T淋巴细胞单独培养作为对照,正常人CD3+T淋巴细胞分别与正常人HLA-DR-lowCD33+CD11b+MDSC、1,25(OH)2D3联合IL-6诱导的MDSC共培养。通过流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T淋巴细胞增殖情况。4.收集1,25(OH)2D3和IL-6刺激的PBMC(实验组)以及未处理组的PBMC,通过流式细胞分析仪对两组MDSC表面CD80、CD86、PD-L1分子进行分析。5.全波长酶标仪检测实验组的HLA-DR-lowCD33+CD11b+MDSC与CD3+T淋巴细胞共培养上清中精氨酸酶(arginine,Arg)活性和一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度。6.通过流式细胞分析仪检测1,25(OH)2D3联合IL-6组和未处理组吞噬荧光乳胶微球的MDSC百分比。7.流式细胞分析仪检测1,25(OH)2D3联合IL-6诱导的MDSC与未处理组的MDSC中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的表达情况。结果:1.诱导MDSC细胞所占比例情况:未处理组MDSC 比例为(2.83±1.38)%,阳性对照组(GM-CSF+IL-6 组)MDSC 比例为(10.41±1.12)%,1,25(OH)2D3组 MDSC 例为(6.67± 1.71)%,1,25(OH)2D3+IL-6 组 MDSC 比例为(10.99± 1.37)%,GM-CSF+1,25(OH)2D3组MDSC 比例为(4.73±0.94)%;1,25(0H)2D3+IL-6组中MDSC细胞比例增高,且具有显著差异(P=0.000);并且1,25(OH)2D3+IL-6组诱导的MDSC细胞均为单核型MDSC(M-MDSC)。2.与未处理组相比,1,25(OH)2D3联合 IL-6 刺激的 PBMC30min、60min、120min和180min后胞内p-STAT3的直方图明显右移,但是1,25(OH)2D3联合IL-6刺激的PBMC30min、60min、120min和180min后胞内p-STAT5的直方图无明显变化。结果显示:1,25(OH)2D3联合IL-6可以上调PBMC胞内STAT3磷酸化表达水平。与1,25(OH)2D3联合IL-6组相比,加入JAK抑制剂后STAT3磷酸化水平明显下降。3.本实验将正常人CD3+T淋巴细胞单独培养为对照组;1,25(OH)2D3+IL-6诱导出的MDSC与正常人CD3+T淋巴细胞共培养的CD3+T淋巴细胞为实验组,CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞增殖的基本情况如下:(87.57±3.59)%,(72.13±2.02)%与(57.33±8.46)%,(38.30±5.19)%。其中,1,25(OH)2D3+IL-6 诱导的 MDSC 既可以抑制 CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的增殖,结果具有统计学意义(P=0.005)、(P=0.001)。同时与正常的MDSC 比较显示,1,25(OH)2D3联合IL-6诱导的MDSC具有更强的抑制CD8+T淋巴细胞增殖的能力。4.未处理组CD80、CD86、PD-L1的平均荧光强度(MFI)分别为(370.47±26.50),(863.97±65.93),(666.80±16.63);1,25(OH)2D3+IL-6 组 CD80、CD86、PD-L1 的MFI 值分别为(381.35±29.78),(1690.20±32.17),(1590.20±295.59)。与未处理组相比,1,25(OH)2D3+IL-6组MDSC的CD86和PD-L1的表达显著增加(P=0.000)、(P=0.032),CD80的表达无统计学差异(P=0.661)。5.本实验对照组上清和实验组上清中精氨酸酶活性以及NO的浓度基本情况如下:(0.31±0.08)U/L,(62.00±6.21)umol/L 与(0.42±0.05)U/L,(75.78±11.37)umol/L。与对照组相比,实验组上清中NO浓度明显增加,差异具有统计学意义(P=0.045);由此推论1,25(OH)2D3联合IL-6诱导的MDSC通过iNOS代谢途径抑制T淋巴细胞的增殖,实验组和对照组上清精氨酸酶活性无变化,差异无统计学意义(P=0.268)。6.未处理组MDSC吞噬荧光微球百分比为(35.73±6.75)%,1,25(OH)2D3+IL-6组MDSC吞噬荧光微球百分比为(60.83±7.68)%;与未处理组相比,1,25(OH)2D3+IL-6组MDSC吞噬能力明显增强(P=0.049),差异具有统计学意义,1,25(OH)2D3+IL-6组MDSC与单核细胞比较,二者的吞噬功能无明显区别(P=0.1.000),差异无统计学意义。7.未处理组的ROS弱阳性的比例和ROS强阳性比例分别为(45.90±11.11)%,(54.10±11.11)%;1,25(OH)2D3+IL-6组的ROS弱阳性的比例和ROS强阳性比例分别为(19.43±9.97)%,(80.57±9.97)%。与未处理组相比,1,25(OH)2D3+IL-6 组 MDSC的ROS强阳性的比例表达增加(P=0.012),ROS弱阳性的比例的表达减少(P=0.012)。结论:1,25(OH)2D3联合IL-6通过刺激PBMC胞内STAT3磷酸化水平诱导PBMC向单核细胞型MDSC分化,同时MDSC通过一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)代谢途径明显抑制CD4+T和CD8+T淋巴细胞增殖。与正常的MDSC 比较,发现1,25(OH)2D3联合IL-6诱导的MDSC具有更强的抑制CD8+T淋巴细胞增殖的能力,并且诱导的MDSC表面CD86、PD-L1分子表达更强,此外1,25(OH)2D3联合IL-6可以促进MDSC胞内ROS的分泌并且增强MDSC的吞噬功能。