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腹泻是各阶段猪群的常见疾病,也是影响猪群健康及养猪业经济效益的主要疾病之一。2010年以来,中国乃至世界各养猪国家都出现了大面积仔猪腹泻的问题,临床上主要表现为低日龄仔猪呕吐、水样腹泻、脱水,高发病率和高死亡率(均可达80%~100%),给养猪业造成了巨大的经济损失。江西省是全国主要生猪养殖省份,也经历了此次仔猪腹泻的大规模暴发。然而,导致此次疾病大规模流行的主要因素及致病原却了解不多,针对江西本次疫情的流行病学调查、主要病原的分子生物学特征、可能的或潜在的导致腹泻的新病原及腹泻猪群肠道微生物群落的改变等研究尚未见报道。为此,本研究拟深入调查几种主要的再现腹泻病毒及新现的腹泻相关病毒在江西省腹泻猪群中的流行情况,分析主要病毒的分子特征;采用宏基因组学及生物信息学方法分析比较健康与腹泻仔猪肠道微生物群落结构和功能,探寻潜在的新的肠道致病原,发挖掘肠道微生物结构、多样性、丰度、功能与腹泻的关系,以揭示此次仔猪腹泻大规模暴发的成因、分子流行病学等,为防控该病提供理论基础和技术手段。本研究主要内容和结果如下:1、猪腹泻主要病毒的分子流行病学调查及PEDV全基因组分析2012年10月至2016年1月,从江西省95个发生腹泻的猪场采集了1,552份腹泻猪粪便和肠道样品,用本实验室建立的RT-PCR方法检测了病料中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastraenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)3种主要腹泻病毒。结果表明,3种病毒的感染率分别为:PEDV 58.38%(906/1,552)、TGEV 1.74%(15/861)和PoRV 2.32%(20/861),PEDV与TGEV、PEDV与PoRV的共同检出率均为0.46%(4/861),3种病毒同时检出率为0。腹泻哺乳仔猪的PEDV检出率最高为66.41%(698/1,051),其次为腹泻保育仔猪55.22%(74/134),腹泻母猪37.55%(98/261)和育肥猪33.96%(36/106)。肠道组织中PEDV的检出率66.74%(596/893)显著高于粪便中PEDV的检出率47.04%(310/659)(ANOVA,p<0.05)。本试验完成了2株PEDV江西株的全基因组测序。序列分析表明,2株江西株之间的核苷酸同源性高达99.9%,与参考株之间的同源性为96.3%~99.7%。与参考株相比,江西株有26个碱基的变化,主要集中在Rep和S基因,其中14个碱基的变异导致了氨基酸的变异。进化树分析结果显示,PEDV江西毒株与当前使用的CV777疫苗毒株在进化关系上相距较远,处于不同的进化分支。2、新现猪δ冠状病毒检测、鉴定及全基因组序列分析为检测我国腹泻猪群中新现猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的存在和感染情况,本试验建立了特异性的RT-PCR检测方法,应用建立的方法首次从我国大陆检出了PDCoV,回溯性研究表明最早可从2012年的腹泻样品中检出该病毒。对2012~2016年间,从82个江西省腹泻猪场采集的1,216份样品进行PDCoV检测,结果表明PDCoV的猪场阳性率为62.20%(51/82),样品感染率为30.26%(368/1,216);PEDV和PDCoV混合感染率为14.97%(182/1,216),有一份样品同时检出了PEDV、PDCoV和PoRV 3种病毒。本试验扩增的PDCoV江西株基因组全长为25,419 nt,3’UTR有3 nt插入,该插入导致其比香港毒株HKU 15-44长3 nt,而在S基因3 nt的缺失使其比另一株香港毒株HKU 15-155短3 nt。分子进化树分析表明,本试验测序的PDCoV毒株与其它国家或地区的PDECoV及鸟类δ冠状病毒均在同一进化分支内,与α、β和γ冠状病毒分属不同的进化分支。PDCoV江西株与所有27株PDCoV参考株的全基因组核苷酸序列同源性≥98.8%,与中国大陆PDCoV株CHN-JS-2014及CHN-HB-2014的同源性最高,达99.3%。本试验获得的江西株的E和M基因序列与所有2014年以来确定的PDCoV相应基因序列完全一致,其它各基因相互间的同源性也在97%以上,说明目前流行的各PDCoV毒株遗传学高度相似。3、腹泻与健康猪群肠道病毒宏基因组学比较研究本试验总共选取了45头不同年龄的猪只(3头健康母猪、4头腹泻母猪及4头腹泻后康复母猪及4头健康仔猪、15头腹泻仔猪及15头与腹泻仔猪同窝但无腹泻症状的仔猪)的粪便或肠内容物为研究对象。通过病毒宏基因组学技术,分析了腹泻、感染不发病及健康猪肠道内的病毒群落情况,从所有样品中一共检出了15个病毒科及1个未分类科的28种猪的病毒。平均每个样品检出8.5种病毒,最少的检出了3种病毒,最多的为了17种病毒。样品检出率和读长比例较高的病毒为猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKoV)、PEDV、PDCoV、porcine stool associated circulate DNA virus(PoSCV)、疱疹病毒1型(suid herpesvirus 1,SHV-1)和札幌病毒(porcine sapovirus,PoSaV)。统计分析表明,腹泻猪样品中PEDV读长比例显著高于健康猪PEDV读长的比例(p<0.01),PKoV在健康仔猪中的读长比例显著高于在腹泻仔猪中的比例(p<0.05),而PoSCV在健康及康复母猪样品中的比例显著高于在其它样品中的比例(p<0.05),PoSaV则在康复母猪样品中比例显著高于在其它组样品中的比例(p<0.05)。腹泻后康复母猪虽然不腹泻,但其体内依然存在高丰度的PEDV和PDCoV等腹泻相关病毒,与腹泻猪同窝的无腹泻症状的仔猪肠道也具有高丰度的腹泻相关病毒。4、基于16S rRNA基因序列分析技术的腹泻与健康猪群肠道微生物群落宏基因组学比较研究为研究腹泻猪肠道菌群的宏基因组,本试验采用16S rRNA V1~V3区通用引物及Illumina MiSeq测序平台比较分析了健康、腹泻及腹泻后康复母猪及其所产健康、无症状及腹泻仔猪肠道菌群结构。基于UniFrac距离的PCoA及UPGMA分析结果表明腹泻母猪、无症状及健康母猪肠道菌群结构存在完全分离;10天内健康仔猪与腹泻及无症状仔猪之间肠道菌群结构也完全分离,但腹泻仔猪与同窝无腹泻仔猪肠道菌群结构存在交叠现象。腹泻可引起肠道菌群从门到属,甚至种水平的改变。LEfSe分析表明,在母猪样品中发现脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)科和脱硫弧菌(Desulfovibrio)属细菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和艰难梭菌(Clostridium difficile)等炎症或腹泻相关细菌的丰度均在腹泻母猪肠道内显著升高,而丁酸盐产生菌丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等的丰度显著降低。在仔猪样品中,腹泻及同窝无症状仔猪肠道中普氏菌属(Prevotella)、杆菌属(Bacteroides)、粪球菌属(Coprococcus)和拟杆菌属(Bacteroides)等产生短链脂肪酸的细菌及丁酸梭菌的丰度显著下降,但肠球菌科(Enterococcaceae)、肠球菌属(Enterococcus)、消化链球菌(Peptostreptococcus)及产气荚膜梭菌等致病菌的丰度显著上升。说明PEDV的感染可能会导致肠道有益菌的丰度降低,而致病菌丰度的升高,从而进一步加剧了腹泻及其导致的损伤。5、腹泻与健康猪群肠道微生物宏基因组学比较研究利用Illumina HiSeq测序技术及细菌宏基因组学技术,比较和分析了健康新生仔猪、腹泻仔猪及与腹泻同窝无症状仔猪肠道细菌群落组成和功能水平上的异同。结果表明:在菌群结构方面,健康及无症状仔猪肠道拟杆菌门(Bacteroidetes)是丰度最高的细菌门,其次为硬壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),但腹泻仔猪肠道中拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌丰度显著下降,而变形菌门(Proteobacteria)细菌的丰度则显著上升;在基因功能水平上,基于CAZy、eggNOG和KEGG数据库比对分析表明腹泻仔猪在氨基酸转运与代谢(Amino acid transport and metabolism)、碳水化合物转运与代谢(Carbohydrate transport and metabolism)等功能丰度显著低于健康仔猪肠道这些功能丰度。腹泻仔猪宏基因序列在L1转座元件(L1 transposable element)、转座酶(Transposase)、核酸内切酶/外切酶/磷酸酯酶家族(Endonuclease/Exonuclease/phosphatase family)、RNA依赖的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)及一些未知功能序列显著上升。说明PEDV导致的低日龄仔猪腹泻不仅改变了仔猪肠道菌群结构和丰度,而且影响了仔猪肠道细菌的功能。