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第一部分 克罗恩病外周血单个核细胞中circRNA的差异表达检测目的:本研究旨在通过circRNA基因芯片筛查克罗恩病（Crohn’s disease CD）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中差异表达的circRNAs,并扩大样本量验证CD患者与健康对照组（healthy controls,HCs）PBMCs中circRNA103765的表达差异,发现新的诊断及评估CD的生物学标志物。方法:选取活动期CD患者及健康对照各5例进行circRNA基因芯片筛查,同时扩大样本量纳入60例CD患者及40例健康体检者,通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测受试者PBMCs中circRNA103765的表达水平,同时检测血清C反应蛋白（CRP）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及克罗恩病活动指数（CDAI评分）,利用受试者工作特征曲线（ROC）评价circRNA103765的诊断价值。Spearman分析法计算circRNA103765 与 CRP、TNF-α、CDAI 评分之间的相关性。结果:CircRNA芯片筛查共发现384个异常表达的circRNAs,其中155个circRNAs表达上升、229个circRNAs表达下降。扩大样本量证实CD组circRNA103765 相对表达水平明显高于 HCs 组（P＜0.05）。CircRNA103765 诊断 CD的曲线下面积（AUC）为0.7015。此外,CD组中circRNA103765相对表达量与CRP（R2=0.2986,P＜0.001）、TNF-α（R2=0.5122,P＜0.001）和 CDAI（R2=0.5625,P＜0.001）呈正相关。结论:CD患者PBMCs中circRNA103765表达明显上调,且可作为CD诊断及疾病活动评估的潜在生物学标志物。第二部分活动期CD患者予抗TNF-α单克隆抗体治疗前后circRNA103765表达水平检测目的:检测活动期CD患者在予抗TNF-α单克隆抗体治疗前后circRNA103765的表达变化,旨在分析治疗前后circRNA103765表达变化与TNF-α表达之间的相关性。方法:选取45例活动期CD予抗TNF-α单克隆抗体（英夫利昔,IFX）治疗。观察输注IFX后的临床治疗效果,在IFX治疗前及第四次IFX输注前进行circRNA103765 和 TNF-α检测。qRT-PCR 检测治疗前后 PBMCs 中 circRNA103765的表达情况,流式微球捕获芯片技术（CBA）法检测外周血TNF-α水平,Spearman分析法计算circRNA103765与TNF-α之间的相关性。结果:45例活动期CD予IFX治疗后,21名CD患者获得临床缓解（CDAI＜150）,13名有临床应答（CDAI下降≥70但CDAI≥150）。11名CD患者IFX治疗失败（CDAI≥150并且CDAI下降≤70）。临床缓解组和应答组的CD患者在IFX治疗后的circRNA103765水平与IFX诱导治疗前相比明显降低（P＜0.05）。而在治疗失败组中未观察到circRNA103765的表达变化。TNF-α在临床缓解组中的水平与IFX诱导治疗前相比明显降低（P＜0.05）。但在临床应答组和治疗失败组中未观察到TNF-α表达的明显变化（P＞0.05）。此外,在CD患者接受IFX治疗前后,临床缓解组中TNF-α水平与circRNA103765的表达有显著正相关（P＜0.05）。而在临床应答组或失败组中,circRNA103765与TNF-α之间无明显相关性。结论:IFX治疗可有效降低临床缓解组中circRNA103765和TNF-α的表达水平,且两者之间的表达变化呈正相关。第三部分CircRNA103765在TNF-α刺激人小肠上皮细胞株后的表达变化及对细胞增殖、凋亡的影响目的:观察TNF-α体外刺激人小肠上皮细胞株后引起的circRNA103765表达变化及对细胞增殖、凋亡的影响。方法:设置空白对照组（未处理组）、TNF-α刺激组（TNF-α刺激小肠上皮细胞株 Caco-2 和 HIEC）、z-VAD-FMK（广谱 caspase 抑制剂）预处理组及 si-circRNA103765（小干扰RNA）干预组,qRT-PCR检测各干预因素刺激后circRNA103765的表达变化;CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡;Western blot免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白（Bax,Bcl-2,活性半胱天冬酶-3（cleaved caspase3））的表达变化。结果:与空白对照组相比,TNF-α刺激组circRNA103765表达明显上调,并且呈剂量和时间依赖性;同时TNF-α显著增加了小肠上皮细胞凋亡率,促进了凋亡蛋白Bax和cleaved caspase3的水平并降低Bcl-2的表达（P＜0.05）。而与TNF-α刺激组相比,z-VAD-FMK预处理组抑制了细胞凋亡的同时也下调了 circRNA103765的表达,且呈浓度和时间依赖性。Si-circRNA103765干预组中circRNA103765的表达水平下调明显（P＜0.05）。而si-circRNA103765干预组与TNF-α刺激组相比显著促进了 Caco2和HIEC的细胞增殖（P＜0.05）,同时降低了细胞凋亡率（P＜0.05）,下调了细胞凋亡相关蛋白的表达。结论:TNF-α在体外刺激人小肠上皮细胞株后circRNA103765表达上调。抑制细胞凋亡可下调circRNA103765的表达。而敲减circRNA103765在下调circRNA103765的同时可缓解TNF-α刺激引起的细胞凋亡并促进细胞增殖。第四部分 CircRNA103765通过miR-30靶向DLL4/Notch信号通路调控人肠上皮细胞增殖、凋亡目的:验证circRNA103765是否通过海绵吸附miR-30靶向DLL4/Notch信号通路调控人肠上皮细胞增殖、凋亡。方法:通过TargetScan和miRanda数据库预测了 circRNA103765的靶基因。qRT-PCR检测抗TNF-α单克隆抗体治疗前后CD患者PBMCs中miR-30的表达变化。双荧光素酶报告基因分析和荧光原位杂交（FISH）检测circRNA103765和miR-30的共定位情况。转染miR-30a-5p/miR-30e-5p相似物或拮抗剂行挽救性实验,qRT-PCR检测circRNA103765的表达情况;CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡;Western blot免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白及Notch信号通路相关蛋白（Bax,Bcl-2,cleaved caspase3,DLL4,NICD,Hes1）的表达情况;Spearman分析法计算circRNA103765与miR-30之间的相关性。结果:TargetScan和miRanda数据库预测发现circRNA103765与miR-30家族的部分序列互补（miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p）。在抗 TNF-α 单克隆抗体治疗前后CD患者的PBMCs中,circRNA103765的表达水平与miR-30a-5p和 miR-30e-5p 的表达呈负相关（P＜0.001）。但 circRNA103765 与 miR-30b-5p 或 miR-30d-5p之间没有显著相关性。双荧光素酶报告基因分析显示circRNA103765与miR-30a-5p或miR-30e-5p呈海绵吸附关系。FISH实验进一步证实circRNA103765（红色）和miR-30a-5p/30e-5p（绿色）主要在细胞质内共定位。挽救性实验证实,转染miR-30a-5p/miR-30e-5p相似物可以挽救由TNF-α诱导的细胞增殖和凋亡效应。相反,miR-30a-5p/miR-30e-5p拮抗剂逆转了 circRNA103765下调导致的细胞增殖和凋亡效应。此外,TNF-α诱导circRNA103765升高的同时也上调了 DLL4和下游NICD和Hes1蛋白和mRNA的表达水平,而敲减circRNA103765则下调了其mRNA和蛋白的表达水平。结论:CircRNA103765 通过 CircRNA103765/miR-30/DLL4 轴调控 Notch 信号通路促进人肠上皮细胞增殖和凋亡