研究背景：　　原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在我国恶性肿瘤病死率中排第二，高发于东南沿海区域。我国每年新增肝癌病人13余万例，占全世界每年新增病人的40％～50％。　　肝癌的治疗方法，分为外科治疗与非外科治疗。外科治疗主要有三种方法：外科切除；外科消融治疗及肝移植。外科切除是疗效最好的治疗方法，但是总体手术切除率低，复发率高。外科消融治疗以其侵袭性小、操作简便的显著优势，但消融治疗即使完全杀灭肿瘤，术后1年内复发率仍高达24％～49％。第三种方法是肝移植，可是肝供体极为缺乏，因此不能成为主要治疗手段。除了以上的外科方法，还有另外的一些治疗手段，例如放化疗、中医治疗、生物疗法。这三种方法通常会联合使用，但效果都比较有限。　　除了治疗效果有限外，更为重要的是至今为止原发性肝细胞癌的发生发展机制还不明了。因此，阐明肝癌侵袭转移发生的分子机制，特别是其转移机制，为将来建立相应的阻断途径及建立治疗靶点具有重要意义。　　肿瘤转移是一个复杂的、多阶段的演化过程，它受多种因素的调节。肿瘤通常以四种方法转移，直接蔓延法；淋巴系统转移法；血液系统转移法，癌细胞脱落后种植法。　　研究表明，细胞骨架蛋白的分布与肿瘤的转移能力密切相关，它们主要由微管、肌动蛋白纤维（actin filament）和中间丝三类蛋白质纤维组成。其中，肌动蛋白纤维主要参与细胞形态的维持，细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达和细胞分化。　　细胞运动的起始是细胞伪足的形成，肌动蛋白纤维的成核反应是启动细胞伪足形成的关键。这个反应受 Arp2/3复合物调节，而 Arp2/3复合物受到 WASP蛋白家族成员（Wiskott-Aldrich syndrome family protein）调控，该蛋白家族包括 WASP、N-WASP、WAVE1、WAVE2和WAVE3。　　Nck是WASP家族蛋白的其中一个重要的结合蛋白，又称衔接蛋白（adaptor protein）。它具有一个SH2（Src homology domain）结构域和三个SH3结构域。其中SH2主要是接受细胞内、外酪氨酸磷酸激酶信号。酪氨酸磷酸化蛋白是一种关系到细胞的增殖，生长，分化，粘连的蛋白，它是细胞信号通路中关键的调节器，在肿瘤发生发展以及肿瘤侵袭及转移过程中起到重要作用。SH2结合酸磷酸信号后，再通过SH3与WASP-Arp2/3复合物结合，进行细胞形态和细胞运动的调控。　　蛋白质组学是目前迅速发展的一门学科。能够高通量、大规模地研究正常和病理情况下细胞，组织中蛋白质表达及翻译的变化，可筛选用于疾病诊断、治疗及预后的生物标志物等，使得它正成为生物医学中的研究热点。目前，蛋白质组学广泛应用于血液，尿液，唾液等组织的研究。　　GST pull-down是体外研究蛋白间相互作用的方法之一，应用也非常广泛。　　综上所述，我们构建了Nck1-SH2融合蛋白并采用GST-Nck1-SH2 pull down分别在非HCC组织与HCC组织中捕获与Nck1-SH2相互作用的蛋白，再结合蛋白质组学方法进一步寻找差异表达的蛋白，最后研究差异蛋白在肝癌细胞迁移中的作用。　　实验结果表明，Nck1-SH2结合蛋白在HCC组织中明显高于非HCC组织。质谱鉴定出以下13种蛋白：Cytoplasmic protein NCK1, Dermcidin1(DCD), Dermcidin precursor, Actin(aortic smooth muscle), Engulment and cell motility protein（ELMO1）, Longevity assurance homolog2,60S acidic ribosomal protein P2, Carbonyl reductase(NADPH)1, E3 ubiquitin-protein ligase, Actin(cytoplasmic1),Heat shock70kDa protein1等。　　生物信息学分析发现以上大部分蛋白多为转运结合蛋白、细胞骨架蛋白、酶类等，其中差异蛋白Dermcidin（DCD）是一种潜在的致癌因子，有研究表明它可能和癌细胞转运相关，于是我们对它进行重点研究。我们比较DCD在肝癌组织，非HCC组织，肝癌细胞株中的表达情况，结果显示DCD在肝癌组织及高转运的癌细胞中是表达明显升高；我们也验证了在肝癌组织及肝癌细胞中，均存在DCD-Nck的相互作用，且DCD-Nck的相互作用是依赖于DCD的酪氨酸磷酸化；最后应用迁移实验（Transwell）验证DCD-Nck的相互作用能促进肝癌细胞的迁移、激活肝癌细胞的Rac1的活性， DCD-Nck的相互作用是DCD诱导的Rac1激活和肝癌细胞迁移的必要条件。　　我们的研究结果进一步阐明了肝癌侵袭转移分子机制，可能为今后肝癌的临床治疗提供新的治疗靶点。　　第一部分蛋白质组学筛选Nck1-SH2相互作用蛋白　　一、目的：　　通过GST-Nck1-SH2 pull down及蛋白质组学方法筛选非HCC组织与HCC组织中的Nck相互作用的差异蛋白。　　二、方法：　　一方面构建GST-Nck1-SH2融合蛋白；另一方面提取非HCC组织和HCC组织总蛋白，将GST-Nck1-SH2融合蛋白与肝组织总蛋白共同孵育，去除杂质后进行双向电泳。利用 ImageMaster软件寻找差异蛋白，选取差异蛋白点，胶内酶解后行肽指纹图谱分析及生物信息学分析，鉴定差异蛋白。　　三、结果：　　通过GST-Nck1-SH2 pull down及2D clear up等技术，获得理想的样本，并成功进行下游的双向电泳技术，得到理想的双向电泳图谱。选择T/N>2倍的蛋白点15个，进行质谱鉴定，鉴定出13种蛋白差异蛋白。分别是：Nance-Horan syndrome protein, Cytoplasmic protein NCK1, Engulment and cell motility protein1（Elmo1）, Actin(aortic smooth muscle), Dermcidin(DCD), Dermcidin precursor，60S acidic ribosomal protein P2, DPI of Desmoplakin, Heat shock70kDa protein1， Max binding protein, Carbonyl reductase(NADPH)1, E3 ubiquitin-protein ligase, Actin(cytoplasmic1), Longevity assurance homolog2等。经分析，以上大部分蛋白是参与物质转化和能量代谢的酶类、细胞骨架蛋白、分子伴侣等。　　四、小结：　　成功利用GST-Nck1-SH2 pull down获得与NCK相关的蛋白并利用双向电泳技术进行分离，质谱分析鉴定出13个可能对肝癌侵袭转移有影响的蛋白。　　第二部分 DCD-Nck相互作用在肝细胞癌侵袭转移中的作用研究　　一、目的：　　验证差异蛋白DCD在非HCC组织，肝癌组织，肝癌细胞株中的表达情况，同时体外验证DCD-Nck相互作用在肝细胞癌转移中所起到的作用及其机制。　　二、方法：　　应用Western blot等技术验证DCD在各种肝癌细胞株，肝癌组织及非HCC组织中的表达情况；用4G10抗体检测DCD-Nck的相互作用是否依赖于DCD的酪氨酸磷酸化；采用co-IP技术及GST pull down验证在肝癌组织及肝癌细胞中DCD-Nck相互作用；应用迁移实验（Transwell）检测DCD对肝癌细胞迁移能力的影响；检测Rac1活性。　　三、结果：　　DCD在高转运的肝癌细胞株中表达明显高于低转运肝癌细胞株；在肝癌组织中的表达也显著高于正常组织。我们的实验结果表明，无论是肝癌细胞株还是肝癌组织中都存在DCD-Nck的相互作用； DCD-Nck的相互作用依赖DCD的酪氨酸磷酸化；Transwell实验及Rac1活性检测分析结果表明DCD的野生株可以显著增加肝癌细胞的迁移能力和Rac1的活性，而其突变体会降低肝癌细胞的迁移能力和Rac1的活性；DCD-Nck的相互作用是DCD诱导Rac1激活和促进肝癌细胞迁移的必要条件。　　四、小结：　　本研究分别检测了DCD在肝癌细胞株及肝癌组织中的表达情况；体外验证了DCD-Nck确实存在相互作用，这种相互作用依赖DCD的酪氨酸磷酸化；DCD-Nck相互作用能促进肝癌细胞的迁移、激活肝癌细胞的Rac1的活性；DCD-Nck的相互作用是DCD诱导的Rac1激活和肝癌细胞迁移的必要条件。　　全文结论：　　本研究通过GST-Nck1-SH2 pull down成功获得非HCC组织与HCC组织中Nck相互作用蛋白，然后利用双向电泳技术，找出差异蛋白，通过质谱分析成功鉴定出13种与肝癌侵袭转移相关蛋白。本研究重点检测差异蛋白DCD在肝癌细胞株及肝癌组织中的表达情况，证明DCD在肝癌组织及高转运癌细胞中表达明显增高。同时，我们进行体外实验证明DCD-Nck存在相互作用，这种相互作用依赖DCD的酪氨酸磷酸化，它能促进肝癌细胞的迁移、激活肝癌细胞的Rac1的活性。DCD-Nck的相互作用是DCD诱导的Rac1激活和肝癌细胞迁移的必要条件。　　我们的研究结果进一步阐明了肝癌侵袭转移分子机制，可能为今后肝癌的临床治疗提供新的治疗靶点。