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研究背景研究表明,各种大型手术以及急性战创伤引起的急性小肠缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤已成为临床常见的诱发肠黏膜屏障(intestinal epithelial barrier,IEB)损伤、肠衰竭,甚至多器官障碍的重要原因之一[1-3]。作为肠道神经系统最丰富的细胞类型,肠胶质细胞(enteric glial cell,EGC)已被证实与IEB功能调控关系密切[4]。研究显示,EGC不仅在肠神经元营养支持和保护方面发挥着关键作用,同时也在保持IEB结构与功能稳定性方面发挥基础性调节作用[5]。因此,如何从EGC角度进一步阐明肠I/R损伤机制,加强小肠IEB损伤保护是当前亟待解决的重要问题。腺苷酸A2A受体(adenosine 2a receptor,A2AR)是一类G蛋白偶联受体,其与腺苷结合后激活诱导活化腺苷酸环化酶,促进第二信使c AMP的合成并产生相应的生物学效应[6]。前期已有研究发现,活化的A2AR可在心、肺、肝等多个脏器的I/R损伤中发挥重要的保护作用:A2AR可通过调控多个炎症介质作用、抑制炎症反应缓解组织损伤[7-10]。A2AR在肠I/R过程中发挥何种作用目前仍不清楚,但近年研究提示A2AR在肠道抗炎症反应中发挥重要作用,提示A2AR在肠I/R损伤进程中的潜在保护作用[11]。本研究利用野生型及A2AR基因敲除小鼠对比观察正常及肠I/R模型中肠屏障功能及结构改变,同时通过建立EGC与肠上皮细胞系IEC-6的共培养体系,干预EGC细胞A2AR活性来观测其在正常及缺氧再复氧(hypoxia reoxygenation,HR)刺激下对IEC-6屏障功能及中ZO-1表达变化的影响,进一步探讨小肠I/R刺激下A2AR在介导EGC调控IEB中的作用机制,以期为发现肠损伤保护新靶点提供依据。研究内容及方法1.借助EGC-IEC-6细胞共培养模型及IEC-6细胞缺氧再复氧(HR)模型,通过给予A2AR激动剂或拮抗剂前期干预EGC细胞中A2AR活性,利用跨上皮电阻(TER)及Western Blot技术检测IEC-6细胞屏障功能及紧密连接蛋白ZO-1表达,对比观察生理及病理情况下干预EGC A2AR表达对IEC屏障功能的影响。同时利用q PCR技术检测EGC细胞内IL-1β、TNF-αmRNA变化,探索其分子机制。2.通过手术夹闭肠系膜动脉建立小鼠小肠I/R损伤,HE染色技术对比观察A2AR野生型及A2AR敲除(A2AR-/-)小鼠小肠黏膜形态学变化,使用Ussing Chamber技术对比观察A2AR野生型及A2AR-/-小鼠肠黏膜通透性变化情况。3.免疫荧光技术对比观察小鼠小肠ZO-1表达分布变化情况。Western Blot技术对比观察A2AR野生型及A2AR-/-小鼠小肠肠上皮细胞中ZO-1表达变化情况。研究结果1.跨上皮电阻(TER)检测及Western blot检测肠上皮细胞ZO-1蛋白变化可以发现,正常条件下与EGC共培养可使IEC-6细胞中ZO-1蛋白的表达明显上调,TER值明显上升(p<0.05);而与之相比,给予EGC细胞A2AR激动剂CGS21680预处理组可进一步促进IEC-6细胞ZO-1蛋白表达水平及TER值上调(p<0.05)。同时,缺氧再复氧(HR)刺激可明显抑制EGC细胞对IEC-6细胞ZO-1蛋白表达及TER值的上调作用(p<0.05),而给予A2AR激动剂CGS 21680预处理EGC后可明显恢复ZO-1表达水平及TER值上升,给予A2AR拮抗剂ZM241385处理则使HR的损伤作用进一步加强(p<0.05)。2.q PCR法检测EGC细胞促炎症因子表达发现,与正常组相比,HR条件下IL-1β、TNF-α的mRNA水平明显上调(p<0.05);与HR组相比,给予A2AR激动剂CGS 21680作用EGC后,IL-1β、TNF-α的m RNA水平明显下调,而给予A2aR拮抗剂ZM241385作用后则IL-1β、TNF-α表达进一步明显上调(p<0.05)。3.通过Ussing Chamber系统检测小肠上皮通透性发现,假手术组和A2AR-/-+假手术组小肠黏膜上皮通透性差异无统计学意义(p>0.05);与假手术组相比,I/R组与A2AR-/-+I/R组的TER值分别下降了约46%和62%(p<0.05);相比I/R组,A2AR-/-+I/R组的TER值也显著下降(p<0.05)。4.小肠HE染色显示,假手术组及A2AR-/-+假手术组小肠黏膜完整、排列整齐、无明显水肿,绒毛无断裂脱落;与这2组相比,I/R组小肠黏膜结构出现破坏,部分绒毛出现水肿、断裂,而A2AR-/-+I/R组可见小肠黏膜结构明显紊乱、水肿,绒毛断裂脱落明显增多。A2AR-/-+I/R组小肠黏膜结构的破坏程度明显重于I/R组,提示A2AR基因敲除可加重I/R刺激对小鼠小肠的结构损伤作用,Chiu评分也与其趋势一致。5.免疫荧光观察发现,紧密连接蛋白ZO-1在肠上皮细胞表面呈线性分布,细胞质、细胞核内未见表达。假手术组及A2AR-/-+假手术组中ZO-1荧光呈连续性表达,且假手术组荧光强度高于A2AR-/-+假手术组(p<0.05),提示A2AR基因敲除可下调肠上皮ZO-1表达。与假手术组相比,A2AR-/-+I/R组与I/R组ZO-1荧光强度明显弱化,且A2AR-/-+I/R组的ZO-1荧光强度低于I/R组(p<0.05)。6.EGC特异性标志物GFAP染色分析显示,GFAP蛋白主要在肠绒毛内部基底层呈点状分布表达,荧光呈红色,主要表达于EGC胞浆内,与A2AR-/-组相比,A2AR-/-+假手术组中GFAP蛋白染色明显增多(p<0.05);且相对于假手术组,A2AR-/-组中GFAP也明显增多(p<0.05),提示A2AR基因敲除及I/R下EGC细胞明显被活化。根据GFAP及ZO-1双标结果,提示A2AR在肠I/R损伤中的保护作用可能与A2AR介导EGC对肠上皮间紧密连接蛋白ZO-1的调控有关。7.提取各组肠上皮细胞总蛋白,Western blot法检测显示,与假手术组相比,A2AR-/-+假手术组ZO-1的表达明显下调(p<0.05),进一步印证A2AR对ZO-1的调控作用;而I/R组ZO-1表达下降了约47%,A2AR-/-+I/R组ZO-1表达则下降了60%;并且后2组比较差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.A2AR参与了EGC与IEC之间的细胞对话,EGC可通过A2AR信号通路上调IEC细胞紧密连接蛋白ZO-1表达来保护IEB功能,抑制H/R刺激对IEB的损伤作用。2.A2AR基因敲除可明显加剧急性IR刺激诱导的肠黏膜结构损伤,IEB损伤加重,同时伴随着紧密连接蛋白ZO-1蛋白的表达显著下调,提示A2AR蛋白在急性I/R刺激下的IEB功能调控中发挥着保护性作用,A2AR有可能成为IEB功能保护新的干预靶点。3.A2AR基因敲除小鼠小肠粘膜内EGC标志物GFAP蛋白表达明显比野生型升高,提示A2AR可能通过调节EGC活性来参与肠屏障调控。