恶性胶质瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)是最高发的颅内恶性肿瘤,患者平均生存期不足15个月。由于其发生位置的特殊性及复杂的生物学特性,传统的手术、化疗及放疗很难完全将其治愈。近年来,溶瘤病毒疗法作为一种恶性肿瘤治疗的新型疗法被广泛关注。据统计目前至少有14项应用溶瘤病毒治疗恶性胶质瘤的方案开展了临床研究,使用的溶瘤病毒类型包括腺病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒等,其中应用最多的病毒类型为腺病毒。目前开发的溶瘤腺病毒大多是由人5型腺病毒(Ad5)改造而来,又称为条件复制型Ad5(CRAd5)。Ad5感染细胞依赖于病毒的纤维蛋白(fiber)结合细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR),实现病毒在细胞上的锚定。而CAR在胶质瘤细胞中通常低水平表达,正常组织细胞的CAR表达量普遍高于胶质瘤细胞,这将导致腺病毒对胶质瘤细胞的靶向感染性不强,严重限制了溶瘤腺病毒在恶性胶质瘤治疗中的应用。另外,由于血脑屏障的存在及病毒自身感染性质的限制,包括溶瘤腺病毒在内的、进入临床研究阶段的溶瘤病毒对恶性胶质瘤治疗的给药方式均为瘤内(颅内)给药。这种给药方式病毒的扩散受限,不能有效感染距离给药位置较远的肿瘤细胞。因此,对于极易多中心发生、侵袭性强、易复发转移的恶性胶质瘤而言,瘤内给药的方式治疗效果有限。针对上述问题,本论文的主要目的为:利用基因工程手段对溶瘤腺病毒衣壳进行修饰,改变溶瘤腺病毒的感染性质,增加溶瘤病毒对恶性胶质瘤细胞的靶向感染能力,并希望构建一种更适合于静脉全身给药治疗恶性胶质瘤的溶瘤腺病毒载体。迄今为止,已经发现数十种血清型的人腺病毒,归属于7个亚群。不同亚群的腺病毒感染性质不同,如C亚群的Ad5感染依赖CAR,而来自D亚群的Ad37则通过唾液酸(SA)感染细胞。唾液酸是神经发育过程中的重要分子,在脑内大量表达,并且有研究报道唾液酸的表达量与肿瘤的恶性程度相关。因此,我们假设:若将CRAd5识别受体的纤维蛋白头节区(knob)替换为Ad37的knob(Ad37-knob,K37),构建fiber嵌合型溶瘤腺病毒,或可改变溶瘤腺病毒的感染性质,使其可以通过唾液酸作为受体感染细胞,此嵌合病毒将有潜力更高效地感染并溶解胶质瘤细胞。另外,我们还期待该策略能够增强溶瘤腺病毒穿透血脑屏障的能力。本论文第一部分工作即围绕此假设展开。经过病毒骨架质粒构建、病毒包装筛选及纯化等步骤,我们成功构建Ad37-knob替换型溶瘤腺病毒(CRAd5/K37)。通过体内外研究探明了Ad37-knob替换策略可改变溶瘤腺病毒的感染途径,并证明了此策略可显著提升溶瘤病毒对胶质瘤细胞的感染能力(提升十数倍)。而后,对CRAd5/K37血脑屏障穿透能力进行评价,结果显示:CRAd5/K37相比于衣壳未经修饰的CRAd5,能更高效地穿透体外血脑屏障模型的细胞屏障;而在颅内荷瘤小鼠及正常Balb/c小鼠中,静脉注射后CRAd5/K37未见更多的脑内富集。这一现象可能的原因有两个:(1)鼠源细胞唾液酸表达量显著低于对应人源细胞,可能由于人鼠细胞唾液酸的表达差异造成体外人细胞模型中结果与小鼠体内结果不统一。小鼠模型可能不是评价Ad37-knob替换型腺病毒组织分布的合适动物模型。若要进一步明确Ad37-knob替换策略是否能有效提升溶瘤腺病毒血脑屏障穿透能力,可能需要选择更接近于人的动物模型,如灵长类猴模型等。(2)单一knob替换策略可能不足以大幅提升溶瘤腺病毒的脑靶向能力,或许可以通过进一步修饰实现溶瘤病毒的脑靶向。本论文第二部分拟在Ad37-knob替换的基础上,通过在CRAd5/K37的knob区域尝试插入可同时靶向血脑屏障及胶质瘤的双级靶向肽,以期进一步提升溶瘤腺病毒对血脑屏障及恶性胶质瘤的双级靶向能力。通过文献调研,我们首先选择了5种在非病毒载体或其他病毒载体上可成功介导脑靶向的5种靶向肽,并参考Ad5-knob的靶向肽插入位点,设计了10种在Ad37-knob HI loop环或C末端插入靶向肽的修饰形式(K37-peptide)。但在研究中发现:所有K37-peptide蛋白在大肠杆菌中表达效率均远低于未经靶向肽修饰的K37蛋白。而后,成功构建了4种pAd5/K37-peptide腺病毒骨架质粒,但分别与穿梭质粒共转染HEK293均不能成功包装出病毒。最后,我们构建了嵌合fiber(F5/K37及10种F5/K37-peptide)真核表达质粒,转染细胞后,所有F5/K37-peptide的表达均远低于F5/K37的表达效率。至此,我们推断:Ad37-knob的HI loop环及C末端不允许双级靶向肽插入,其具体原因和机制需要未来进一步的研究。除fiber外,腺病毒衣壳蛋白pⅨ同样是腺病毒衣壳修饰的理想位点。实验室前期构建了一种pⅨ的C端通过亮氨酸拉链的二聚作用修饰有肿瘤坏死因子相关凋亡配体(Tμmour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的溶瘤腺病毒载体(A4)。A4病毒在乳腺癌动物模型中表现出非常好的肿瘤靶向性及抑瘤效果。本论文第三部分工作即结合TRAIL表面修饰策略及Ad37-knob替换策略构建一种衣壳双修饰型溶瘤腺病毒(A4/K37),以期使溶瘤腺病毒对恶性胶质瘤具有更好的感染能力及感染选择性。所设计的A4/K37不仅具有Ad37-knob的替换及pⅨ上TRAIL蛋白修饰两种衣壳修饰,还携载TRAIL基因,可介导TRAIL蛋白的表达增强肿瘤杀伤能力。通过病毒包装、筛选及纯化,成功获得A4/K37病毒后,对其基因组及结构性质鉴定,并且分析体外感染性质,最后在荷瘤小鼠中评价了其抑瘤效果。综合本部分结果发现:双修饰策略能够优化病毒对胶质瘤细胞的感染效率及感染选择性;并且A4/K37相比于A4病毒,具有更好的胶质瘤杀伤能力。双修饰策略相比于单修饰策略,能够实现更高效率的复制溶瘤及效力更强的TRAIL基因治疗。综上所述,本论文先后尝试了“Ad37-knob替换”、“Ad37-knob替换基础上靶向肽修饰”及“Ad37-knob替换联合pⅨ上TRAIL修饰的双修饰策略”三种溶瘤腺病毒衣壳修饰策略,以期提升溶瘤腺病毒治疗恶性胶质瘤的潜力。经过实验探究,得出结论:“Ad37-knob替换策略”可改变溶瘤腺病毒的感染性质,使其更适合应用于恶性胶质瘤的治疗;而基于Ad37-knob替换基础上的靶向肽修饰,由于嵌合纤维蛋白的表达受到影响,导致无法包装出病毒;以“双修饰策略”构建的溶瘤腺病毒载体具有更高效的条件复制溶瘤能力,并介导更好的TRAIL基因治疗效果,在恶性胶质瘤的治疗中具有较好的应用前景。