前言肌腱病(tendinopathy)是一种慢性劳损性疾病,病因尚不清楚,普遍认为与肌腱的过度使用直接相关[1]。肌腱持续承受压力和机械负重,不仅能导致急性肌腱损伤而且会引发慢性降解性肌腱病。跟腱,髌骨,肩袖、前臂扩展肌、肱二头肌、胫骨后肌处的肌腱是最易引发肌腱病的部位。肌腱干细胞(Tendon stem cells,TSCs)是一种肌腱腱旁组织来源的间充质干细胞。James H-C Wang和M.de Mos等人研究发现:肌腱干细胞在特定的环境下可以进一步分化为肌腱细胞,且较肌腱细胞而言,肌腱干细胞不仅更能促进细胞的增殖和胶原合成,还能分泌更多的细胞外基质修复损伤的肌腱。肌腱干细胞具有多向分化潜能,在一定条件下能够分化成脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[2-7],在肌腱修复过程中,肌腱干细胞的这种多向分化潜能将发挥重要作用。然而,目前肌腱干细胞的分化机制尚不清楚,研究证实,TSCs在肌腱组织修复方面存在明显的优势。肌腱干细胞来源丰富,肌腱组织含有1%-4%的TSCs;TSCs体外培养增殖能力更强,拥有更短的培养周期,多次传代后仍能保持稳定的干细胞特性[8];TSCs趋向软组织,故其向肌腱、软骨、骨组织的分化趋势更容易;肌腱干细胞免疫原性极低,肌腱干细胞甚至还有免疫抑制性[9]。所以,在肌腱损伤修复方面,肌腱干细胞潜力巨大,前景光明。因此,如何对肌腱干细胞分化方向加以调控,使其向有利于肌腱损伤恢复的方向分化,为肌腱病的治疗指明了新的方向。前人的研究表明前列腺素(PGE2)在肌腱损伤中是疼痛和急性炎症反应的主要炎症调节因子[10,11]。在动物模型中,重复的机械负重会使肌腱中PGE2的表达显著增加,PGE2的增加可以看做是对重复性的负重的反应。前列腺素E2处理肌腱干细胞后,其增殖能力明显降低,不同浓度的PGE2处理肌腱干细胞不同时间,其将向成骨和成脂两种不同的方向分化[5,12]。正常肌腱的腱-骨连接部分有四种不同的组织:肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨及骨。在肌腱损伤修复过程中,肌腱干细胞向软骨和成骨方向的分化是有利于的。而损伤的肌腱中脂肪组织的积累则不利于肌腱病的恢复。因此,如何调控损伤的肌腱中肌腱干细胞的成骨分化和脂质积累,是将肌腱干细胞应用于治疗肌腱病的关键所在。Sirtuin是生命体中广泛存在的一类依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶,Sirt1是目前研究最为广泛的sirtuin蛋白,它在能量代谢和细胞分化过程中起着重要的作用[13]。sirt1通过自身的去乙酰化活性发挥其调节作用,其中组蛋白的去乙酰化是sirt1调节细胞分化的主要机制[14]。在细胞分化中多种非组蛋白也是sirt1的靶标,研究显示,sirt1将runx2和β-catenin[15]去乙酰化,来调节间充质干细胞的成骨分化[16]。ppar?在间充质干细胞成骨成脂分化平衡中起着重要作用[17,18]。白藜芦醇能促进间充质干细胞的成骨分化[19,20]。同样被激活的sirt1能够减少脂肪细胞数目,增加成骨分子标记的表达,而sirt1被抑制后,则会增加脂肪细胞数目和成脂分子标记,减少成骨分子标记的表达,因此被激活sirt1起到抑制成脂分化促进成骨分化的作用[21]。sirt1在细胞分化中的作用及其调控机制,为我们的课题指明了方向。肌腱病在运动医学中是一种高发病,目前临床普遍采取抗炎治疗,通过减少炎性因子pge2达到减轻肌腱及腱周疼痛的目的。近年来自体肌腱干细胞治疗自体肌腱病逐渐成为运动医学医生关注的重点。肌腱干细胞具有多项分化潜能,可以正常分化成肌腱,也可以异常分化成骨、成脂,如何调控其异常分化是肌腱病早期康复的关键。在骨髓间充质干细胞中,sirt1是骨系及脂系分化的重要因子,因此,本课题研究炎性因子pge2刺激下导致的肌腱病通过sirt1的调控抑制成脂和成骨促进成肌腱来达到治疗肌腱病的目的,为临床提供治疗肌腱病的新方法。综上所述,本研究主要在前期工作的基础上,检测pge2处理前后的肌腱干细胞其成骨分化能力的改变,并探求其相关的信号通路;构建bmp-2,igf-1,cebpδ,crebandsmad1稳定低表达的细胞模型,探讨pge2处理前后的肌腱干细胞其成脂分化能力的改变,及其可能影响成脂分化的相关信号通路;从基因和蛋白水平检测sirt1激活剂和抑制剂处理不同时间后肌腱干细胞中sirt1的表达情况,并检测处理前后细胞中成骨和成脂的变化,研究sirt1对肌腱干细胞成骨和成脂分化的调控,从而阐明其机制,为肌腱病的发生、发展机制以及生物学治疗提供理论依据,最终达到治疗肌腱病的目的。方法第一部分:分离培养大鼠的肌腱干细胞,并用细胞免疫荧光的方法鉴定肌腱干细胞,检测细胞的标记蛋白的表达;分别用不同浓度的pge2处理肌腱干细胞7天或者用100ng/ml的pge2分别作用1天、3天、7天、14天时,茜素红染色、碱性磷酸酶染色以及油红染色检测处理前后肌腱干细胞中成骨、成脂能力的变化,并通过elisa方法、realtimepcr、westernblot从基因和蛋白水平检测处理前后细胞中bmp2以及成脂基因pparγ的表达;不同浓度的pge2处理大鼠肌腱干细胞7天诱导肌腱干细胞的成脂分化,分别用实时定量pcr方法和elisa从基因和蛋白水平检测肌腱干细胞中igf-1的表达。在pge2处理的肌腱干细胞组中加入mek的抑制剂u0126(10um)、pi3k的抑制剂ly294002(20um)以及akt抑制剂iv(10um),通过免疫印迹的方法分别检测处理前后肌腱干细胞中磷酸化的erk和磷酸化的akt的表达水平。在肌腱干细胞的培养基中加入bmp2(200ng/ml),分别作用1天、3天、7天和14天后,茜素红和碱性磷酸酶检测肌腱干细胞的成骨能力。分别构建bmp-2,igf-1,cebpδ,crebandsmad1稳定低表达的细胞系,检测基因转染前后及pge2处理前后bmp-2,igf-1,camp,pka,cebpδ,smad1的表达。第二部分:分别检测不同浓度的pge2刺激肌腱干细胞不同时间后,细胞中sirt1的表达。并分别用0.2um和0.4um的sirt1的激活剂srt1720处理肌腱干细胞后,从基因和蛋白水平检测肌腱干细胞中sirt1的表达量,同时用0.4um的sirt1的激活剂和0.2um的sirt1的抑制剂分别处理3天、7天、10天、14天后,从基因和蛋白水平检测肌腱干细胞中sirt1的表达量以及成骨相关指标bmp2、runx2和成脂相关指标pparγ的表达,茜素红和油红染色检测细胞成骨成脂分化能力的变化。分别用0.4um的sirt1的激活剂srt1720和0.02um的sirt1的抑制剂ex527处理肌腱干细胞,从基因和蛋白水平检测肌腱干细胞中成骨相关通路sirt1/β-catenin/runx2以及成脂相关通路pi3k/akt/cebp?/ppar?的变化。将100ng/ml的pge2注射到大鼠跟腱腱鞘内,处理4周,构建大鼠肌腱病模型。用0.4um的sirt1激活剂srt1720处理大鼠左侧跟腱,10天后,he染色观察大鼠跟腱组织成骨成脂分化情况。结果第一部分:随着处理时间的延长,肌腱干细胞的成骨能力逐渐增强,当处理14天时,肌腱干细胞的成骨能力最强,同时bmp2激活了下游信号通路smad1,5,8的磷酸化。pi3k的抑制剂ly294002以及akt抑制剂iv不能抑制由bmp2激活的smad的磷酸化,却可以减低runx2的表达并抑制肌腱干细胞的成骨分化能力,mek的抑制剂u0126无上述功能。pi3k/akt信号通路参与到bmp2诱导的肌腱干细胞的成骨分化。随着pge2处理时间的延长和处理浓度的不断增高,肌腱干细胞的成脂分化能力逐渐增强,成脂基因pparγ的表达也逐渐增高。pge2促进了肌腱干细胞的成脂分化。不同浓度的bmp2处理大鼠肌腱干细胞7天或者是用100ng/ml的pge2分别处理细胞3天、7天、10天后,我们发现bmp2单独存在时不能直接介导pge2诱导的成脂分化。随着pge2浓度的增加,处理时间的延长,肌腱干细胞中igf-1的表达逐渐增高。igf-1与pge2之间存在着时间依赖关系和剂量依赖关系。当没有bmp2存在,仅仅是IGF-1单独作用,不能介导PGE2诱导的成脂分化。然而,BMP2和IGF-1共同存在时能够介导PGE2诱导的成脂分化。PGE2或者是IGF-1+BMP-2处理细胞后,细胞中的Smad和CREB被激活,发生了磷酸化。PGE2或者是IGF-1,而不是BMP-2,促进了CREB的磷酸化,当CREB的基因被干扰后,细胞中的IGF-1的表达下调。第二部分:100ng/ml的PGE2分别作用1天、3天、7天、10天发现,肌腱干细胞中有sirt1的表达,且sirt1的表达量随着PGE2浓度的增高而增高,随着PGE2处理时间的延长而延长。且随着sirt1的激活剂SRT1720浓度的增加,不管是基因水平还是蛋白水平,细胞中sirt1的表达增加,处理14天时,表达最高;细胞中成骨指标BMP2.Runx2的表达逐渐增高,成骨能力逐渐增强,细胞中成骨相关通路β-catenin.Runx2的表达逐渐增高,第10天时最高,随后,表达逐渐减低;而成脂相关指标PPARγ的表达逐渐降低,成脂能力逐渐减弱,成脂相关通路PI3K/AKT/CEBP?/PPAR?的表达逐渐降低,第10天时最低,随后,表达逐渐升高。同样的,随着sirt1的抑制剂EX527浓度的增高处理时间的延长,细胞中sirt1的表达降低,第14天时,表达最低;细胞中成骨指标BMP2、Runx2的表达逐渐降低,第10天时最低,随后,表达逐渐升高;而成脂相关指标PPARγ的表达逐渐升高,第10天时最高,随后,表达逐渐减低。100ng/ml的PGE2注射到大鼠跟腱腱鞘内,处理4周,HE染色观察到肌腱及腱周出现异位骨化和脂肪小滴的形成,证明本课题组成功构建了大鼠肌腱病模型。当0.4um的sirt1激活剂SRT1720处理大鼠左侧跟腱,观察10天后,HE染色显示肌腱病的病理情况得到明显改善。结论第一部分:PGE2通过PI3K-Akt信号通路促进了肌腱干细胞的成骨分化。IGF-1和BMP2共同作用促进了了PGE2介导的TSCs的成脂分化。IGF-1和BMP2分别激活了下游的CREB和Smad的磷酸化,从而进一步使成脂基因PPARγ2的表达上调,最终促进了肌腱干细胞的成脂分化。第二部分:肌腱干细胞中发现了sirt1的表达,且Sirt1通过SIRT1/β-catenin/Runx2通路影响了肌腱干细胞的成骨分化,通过PI3K/AKT/CEBP?/PPAR?通路影响了肌腱干细胞的成脂分化。动物模型证实了依赖浓度依赖时间的sirt1激活剂可以抑制肌腱干细胞的成骨和成脂分化。