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生长激素(GH)是由动物脑垂体前叶嗜酸性细胞合成和分泌的一种单链蛋白质类激素,具有广泛的生理作用。本研究应用RT-PCR、RACE、克隆测序等技术首次克隆得到长鬣蜥(Physignathus cocincinus)GH基因全长cDNA及第2、3、4内含子序列,并对其序列结构、氨基酸组成以及蛋白质性质进行了初步分析,对今后爬行动物GH基因的结构、表达调控、基因多态性及其与寿命、生长速度、生产性能相关性、进化等方面的研究起着促进作用。主要研究结果如下:
1.首先利用RT-PCR技术扩增得到长鬣蜥GH基因部分cDNA序列。然后再设计引物,用RACE方法获得5’、3’末端cDNA序列,拼接后获得全长为908bp的cDNA序列。经分析:长鬣蜥GH基因mRNA序列包括62bp的5UTR,651bp的ORF,195bp的3UTR,编码216个氨基酸。根据得到的长鬣蜥生长激素cDNA序列设计引物,扩增得到第2、3、4三个内含子序列,长度分别为2700bp、622bp、1278bp。
2.应用生物信息学对长鬣蜥GH基因全长cDNA序列以及编码的氨基酸序列进行分析表明,长鬣蜥GH基因编码区碱基序列与乌龟、鸡、鹌鹑的同源性依次为76%、76%、75%;氨基酸序列与同属于爬行动物的绿海龟、乌龟、鳄鱼的同源性达79%、77%和76%;其次,与鹌鹑、鸡、鸵鸟和鸭的同源性分别为77%、74%、74%、73%,在分子进化上十分保守;其碱基序列的同源性与氨基酸序列的同源性基本一致。
3.通过Clustal X排列,用UPGMA法构建了26种脊椎动物GH基因的分子进化树,发现:长鬣蜥与同属于爬行动物的乌龟处在同一分支上且与鹅、鸭、鹌鹑、鸡、鸵鸟、火鸡进化距离较近,逐次与哺乳动物(山羊、绵羊、牛、马、狗、猪、人、兔、小鼠、褐鼠)、两栖动物(蝾螈、非洲爪蟾、牛蛙)、鲟鱼聚为第一大类;第二大类中斑马鱼与草鱼首先聚为一类,然后逐次与大马哈鱼、鳗鲡聚为一类。
4.长鬣蜥GH蛋白质分子质量约为24,787.53 Da,等电点pI为8.16,第13个氨基酸位置有一个最大的疏水性位点,分值为3.033,并存在明显的跨膜区域。该肽链信号肽位置为1—28,断裂点位置是28—29(TRA—LP)。从而得出,长鬣蜥GH的氨基酸包括长度为28个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。