Dnmt1基因是DNA甲基化转移酶编码基因的一种,该基因编码DNA甲基化转移酶1(DNMT1),该酶对DNA甲基化的发生以及维持有着重要作用。MeCP2基因是DNA甲基CpG结合蛋白编码基因的一种,该基因编码甲基CpG结合蛋白2,该蛋白是神经细胞正常发育所必须的,并能与DNMT1蛋白相互作用共同维持DNA甲基化状态。本实验室课题组在以往的鱼类杂交育种研究中,利用红鲫(RCC)作为母本,湘江野鲤鲤(CC)作为父本,进行属间远缘杂交,成功培育出了世界上首例两性可育的异源四倍体鲫鲤杂交品系,目前已经形成遗传稳定的异源四倍体鲫鲤(4nAT)群体并成功繁殖了25代(F3-F25)。同时本实验室课题组还利用雄性异源四倍体鲫鲤与雌性二倍体红鲫杂交,得到了不育的异源三倍体鲫鱼(3n)。该三倍体、四倍体鲫鲤的形成为我们研究不同倍性鱼的分子遗传学特征以及表观遗传学特征提供了宝贵的实验材料。在杂交与多倍体化过程中,表观遗传效应对生物体的基因表达与表型特征起着重要的调控作用。甲基化作为表观遗传调控的最主要方式,对4nAT,3n及其亲本雌性RCC和雄性CC编码甲基化转移酶(DNMT1)以及甲基Cp G结合蛋白2(MeCP2)的两个基因的开放阅读框进行序列分析,并对两个基因在不同倍性鱼的不同组织、不同胚胎发育时期以及性腺发育不同时期进行表达研究,对探讨异源四倍体鲫鲤,三倍体鲫鲤与其亲本dna甲基化差异有着重要意义。在实验室相关研究的基础上,本文对dnmt1与mecp2基因进行了开放阅读框序列克隆及氨基酸序列分析,同时比较分析了这两个基因在不同倍性鱼中的表达水平,为进一步从表观遗传学角度探讨3n的不育性特征与基因表达量的关系奠定了基础。本论文的研究结果如下:1.对cc、rcc、3n和4natdnmt1基因与mecp2基因的开放阅读框序列进行克隆,发现dnmt1基因在rcc,3n和4nat中都存在两种类型:dnmt1-α与dnmt1-β;而cc中该基因只有一种类型;其中,rcc的dnmt1-α与dnmt1-β开放阅读框长度分别为4512bp和4521bp,分别编码1503个氨基酸残基和1506个氨基酸残基。ccdnmt1基因其开放阅读框长度为4512bp,共编码了1503个氨基酸残基。3ndnmt1-α与dnmt1-β开放阅读框长度都为4527bp,编码1508个氨基酸残基。4natdnmt1-α与dnmt1-β开放阅读框长度分别为4512bp与4506bp,各编码1503、1501个氨基酸残基。而mecp2基因在cc、3n和4nat中存在两种类型,mecp2-α与mecp2-β,而rcc中该基因只有一种类型;rcc该基因开放阅读框全长为1635bp,编码544个氨基酸;cc的mecp2-α与mecp2-β开放阅读框全长度分别为1638bp和1623bp,分别编码545和540个氨基酸残基。3n两种类型mecp2-α与mecp2-β开放阅读框序列长度分别为1623bp和1632bp,分别编码540和543个氨基酸残基。4nat的两种类型mecp2-α与mecp2-β开放阅读框序列长度分别为1623bp和1638bp,分别编码540和545个氨基酸残基。通过对比分析4nat、3n及其父母本dnmt1基因和mecp2基因开放阅读框序列,发现两种多倍体杂合子两个基因编码区都发生了插入、重组等变异。2.采用rt-pcr的方法比较分析dnmt1基因在四种鱼不同组织中的mrna表达情况,发现在四种鱼的肌肉,脑,心脏,肝脏,脾脏,肾脏,卵巢和精巢组织中,都有dnmt1基因的表达信号,但是在脑组织和性腺组织中,其mrna表达量相对较高,而在肌肉组织中mrna表达量最低。同样地,采用rt-pcr与q-pcr的方法比较分析dnmt1基因在四种鱼胚胎发育各个时期的表达情况,发现在胚胎发育多细胞期至囊胚早期dnmt1基因mrna表达水平较高,随着胚胎的继续发育,dnmt1基因表达水平呈显著降低,原肠胚期后维持低水平状态。同时,通过比较研究四种鱼dnmt1基因在繁殖期与非繁殖期性腺中的表达情况,发现在两个不同时期,dnmt1基因在卵巢中的表达均比精巢中表达高,并且,在不育3n中,dnmt1基因的表达量低于可育rcc和4nat,而四种鱼精巢中dnmt1基因的表达没有显著差异,该结果表明dnmt1基因与卵巢的发育密切相关。3.采用rt-pcr的方法比较分析mecp2基因在四种鱼不同组织中的mrna表达情况与dnmt1基因表达结果相似,mecp2基因在四种鱼的肌肉,脑,心脏,肝脏,脾脏,肾脏,卵巢和精巢中均有表达,且在脑组织中的表达量最高,而性腺中表达量较高。采用rt-pcr的方法以及q-pcr,比较分析mecp2基因在四种鱼胚胎发育各个时期的表达情况,发现在胚胎发育时期多细胞期至囊胚早期mecp2基因mrna表达水平较高,到原肠胚后表达量下降,然后维持低表达水平直到出膜期。这也与Dnmt1基因在胚胎发育不同时期的结果相似。进一步的,通过比较研究四种鱼性腺在繁殖期与非繁殖期MeCP2基因的表达情况,发现在四种鱼中,MeCP2基因在繁殖期的表达都要低于非繁殖期;并且MeCP2基因在3n卵巢中的表达量水平明显高于RCC和4nAT卵巢表达水平,而在精巢中的表达量随鱼的倍性增加而增加,说明该基因的表达与不同倍性鱼的卵巢发育有着紧密联系。