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本试验采用体内结合体外肝脏细胞培养的方法,从动物机体、组织和细胞水平上探讨5-羟色胺对围产期母羊肝脏糖异生作用的影响机理,为科学有效的改善母羊围产期的能量负平衡,提高围产期母羊机体健康和生产性能提供理论依据。本论文的试验研究包括四个部分。试验1 5-羟色胺对围产期母羊生产性能的影响。试验选择体况良好,体重为64.52±4.11 kg,处于同一围产期的30只巴美肉羊母羊,按体重随机分为3组,即对照组(灌注生理盐水)、5-HTP组(灌注5-羟基-色氨酸,5-HTP)和TRP组(灌注色氨酸,TRP),每个处理组10只母羊。5-HTP组及TRP组在母羊产前第7d至产后第0d进行颈静脉灌注,5-羟基色氨酸及色氨酸的灌注剂量为0.178 mg/kg BW,浓度为0.1 mg/ml。研究5-羟色胺对围产期母羊体重及泌乳量的影响。结果表明:1)5-HTP可以显著提高母羊泌乳期的干物质采食量(P<0.05),5-羟色胺对母羊产后体重增加有显著作用(P<0.05);2)5-羟色胺对母羊产乳量及乳蛋白含量无显著性影响(P>0.05),但使母羊产后3d乳脂含量及乳中非脂固体含量降低,并显著提高乳中乳糖含量(P<0.05)。试验2 5-羟色胺对围产期母羊糖代谢相关血液理化指标的影响。本试验动物分组和饲养管理同试验1。本试验在试验1的基础上,分别于母羊产前第1 d、产后第3、6、9、15和30 d进行颈静脉采血,研究5-羟色胺对围产期母羊糖代谢相关血液理化指标的影响。结果表明:1)灌注5羟基色氨酸与色氨酸可以显著提高围产期母羊产前7 d至产后9 d的5-羟色胺浓度(P<0.05);2)5-羟色胺可以显著提高围产期母羊产前至产后9 d的血糖浓度,降低血浆NEFA浓度(P<0.05)。INS及IGF-1随血糖浓度上升而促进分泌,5-羟色胺显著降低围产期母羊产前至产后9 d的INS及IGF-1浓度(户<0.05)。试验3 5-羟色胺对肝脏糖异生关键基因mRNA表达量及蛋白表达量的影响。本试验动物分组和饲养管理同试验1。本试验在试验1的基础上,将试验动物于饲养试验结束后进行屠宰,利用实时荧光定量PCR和western blotting技术测定肝脏糖异生相关限速酶基因的mRNA和蛋白表达量。结果表明:1)5-羟色胺可使产后9d母羊的肝脏糖异生关键基因PEPCK、G6P和PC的mRNA表达量显著升高(P<0.05),起到了促进肝脏糖异生的作用,灌注5-HTP比较灌注L-TRP对于促进肝脏糖异生关键基因的表达更具优势;2)5-羟色胺可使产后9 d母羊的肝脏糖异生关键基因PEPCK、G6P和PC的蛋白表达量显著升高(P<0.05),说明5-羟色胺不仅在转录水平,也在翻译水平起到促进肝糖异生的作用。试验4 5-羟色胺对围产期母羊肝脏PI3K-AKT-FOXO1信号通路的影响。木试验分为两部分。第一部分为5-羟色胺对羊肝脏组织PI3K-AKT-FOXO1信号通路关键因子蛋白表达量的影响;第二部分为5-羟色胺对羊肝细胞PI3K-AKT-FOXO1信号通路的影响。第一部分的试验动物分组和饲养管理同试验1。在试验1的基础上,将试验动物于饲养试验结束后进行屠宰,利用western blotting技术测定围产期母羊肝脏组织PI3K-AKT-FOXO1信号通路关键因子蛋白表达量。结果表明:5-HTP和L-TRP的灌注显著下调了 PI3K-AKT-FOXO1信号通路的关键基因PI3K、及p-FOXO1的活性(P<0.01),显著降低了 p-FOXO1基因的蛋白表达(P<0.01),提高了母羊产后9d肝脏组织FOXO1基因的蛋白表达(P<0.01),促进了肝脏的糖异生作用,灌注5-HTP比较灌注L-TRP对于促进肝脏糖异生关键基因的表达更具优势。第二部分试验分采用体外法,首先在不同NEFA添加浓度及处理时间下将羊肝细胞随机分为基础培养基组、NEFA组和5-HT+NEFA组三个处理组;其次在不同5-HT添加浓度下将羊肝细胞分对照组、5-HT组及5-HT+转染组三个处理组。利用实时荧光定量PCR、western blotting及基因转染技术,测定肝细胞糖异生关键基因及PI3K-AKT-FOXO1信号通路关键基因mRNA表达量和蛋白表达量。结果表明:1)当NEFA浓度为2.4mmol/L处理时间为24h时,细胞增殖率下降22%,细胞PEPCK的浓度显著升高(P<0.01);2)当添加5-HT浓度为10-3mol/L时,细胞增殖率最高为293.03%,且肝细胞NEFA浓度显著下调(P<0.01),细胞PEPCK的浓度显著升高(P<0.01);3)添加NEFA显著升高了肝脏糖异生关键酶PEPCK、PC及G6P的蛋白表达量(P<0.01),显著升高了 PI3K-AKT-FOXO1信号通路关键基因tFOXO1的蛋白表达量(P<0.01),显著降低了INSR、p-PI3K及p的蛋白表达量(P<0.01),显著降低了 FOXOI的磷酸化和p-FOXO1/t-FOXO1的蛋白表达量(P<0.01);4)添加5-HT可显著升高PEPCK、G6P及FOXO1的蛋白表达量(P<0.01),PC的蛋白表达量略有升高但组间差异不显著(P<0.05),INSR、p-PI3K及p-的蛋白表达量显著降低(P<0.01),t-FOXO1的蛋白表达量显著升高(p<0.01),F的磷酸化和p-FOXO1/tFOXO1的蛋白表达量显著降低(P<0.01);5)当沉默PI3K基因,5-HT显著升高了 PI3K-AKT-FOXO1信号通路关键基因tFOXO1的蛋白表达量(P<0.01),显著降低了INSR、p-PI3K、p-AKT、p-FOX及 p-FOXO1/tFOXO1的蛋白表达量(P<0.01)。综上所述,5-羟色胺可以降低围产期母羊体脂动员产生的NEFA,提高血糖浓度,通过调控PI3K-AKT-FOXO1信号通路关键基因INSR、p-PIK、p-AKT的表达,促进肝脏糖异生关键基因FOXO1、G6PC和PEPCK的表达,对于提高母羊围产期肝脏糖异生,改善能量负平衡具有积极的促进作用。