第一部分温阳活血法对高磷诱导兔主动脉平滑肌细胞钙离子内流的调控目的:探讨温阳活血法对高磷诱导兔主动脉平滑肌细胞钙离子内流的影响材料和方法:将兔主动脉平滑肌细胞随机分为6组,分别为:β-GP(-)组,β-GP(+)组,空白血清组,维拉帕米组,蠲脉I号方温阳拆方组(以下简称拆方组)和蠲脉I号方全方组(以下简称全方组)。10mmol/Lβ-甘油磷酸培养基中添加10%FBS培养兔主动脉平滑肌细胞14天建立钙化模型,β-GP(-)组使用10%FBS培养基进行培养,造模14天完成后,茜素红S(1%,PH4.2)染色判断VSMCs钙化情况。选取8只健康雄性新西兰大白兔制备空白血清组,维拉帕米组,拆方组和全方组含药血清。MTT法检测各组含药血清对兔主动脉平滑肌细胞的毒性作用,计算半数抑制率(IC50)。兔主动脉平滑肌细胞接种至12孔板,分别使用对应的培养基干预6天,加入flou-4 AM探针,荧光显微镜下观察钙化细胞内钙离子荧光强度。采用比色法检测各组兔主动脉平滑肌细胞内钙离子浓度。ELISA测定各组血清干预后兔主动脉平滑肌细胞CAN活性。结果:MTT结果显示β磷酸甘油对兔主动脉平滑肌细胞活力具有抑制作用(P<0.05),抑制率为19.65%;兔空白血清对CCC-SMCs活力具有促进作用(P<0.05),并随着血清浓度的增高,细胞活力增强,5%,10%,15%及20%的空白血清对应细胞活性分别为β-GP(-)组的134.2%,158.7%,161.5%,169.3%。与空白血清组比较,维拉帕米组维拉帕米对兔主动脉平滑肌细胞活性无明显抑制作用(P=0.675);全方组及拆方组随着含药血清浓度增加,对CCC-SMCs的抑制率增加。全方组IC50为19.67%,拆方组IC50为25.98%。茜素红S染色液(1%,PH4.2)结果显示β-甘油磷酸诱导的CCC-SMCs钙化组出现较多橘红色钙结节、细胞质红染;对照组亦可见少量钙化结节形成,细胞质红染。由此表明:CCC-SMC可在正常连续培养14天后自发形成钙化结节,经过β甘油磷酸诱导的CCC-SMCs 14天促进钙化的形成。Fluo4AM荧光探针检测CCC-SMCs内钙离子显示,与β-GP(-)组比较,β-GP(+)组平均荧光强度明显增高,P<0.05,表明β-GP干预后CCC-SMCs内钙离子浓度明显增高;空白血清组较β-GP(-)组荧光强度明显增强,P<0.05,表明兔血清可促进细胞内钙离子内流。以空白血清组作为阴性对照组,全方组、拆方组及维拉帕米组细胞荧光强度均明显较弱,P<0.05,表明全方组、拆方组及维拉帕米组含药血清均可抑制CCCSMCs钙离子内流。通过比色法检测各组含药血清干预6d后,CCCSMCs内钙离子浓度,结果显示,与β-GP(-)组比较,β-GP(+)组平均钙离子浓度明显增高,P<0.05。与空白血清组作为阴性对照组,全方组、拆方组及维拉帕米组细胞内钙离子浓度均较空白血清组明显降低,P<0.05,表明全方组、拆方组及维拉帕米组含药血清均可抑制CCCSMCs钙离子内流。各组含药血清干预6d后,ELISA测定CCC-SMCs内CAN活性。建立标准品曲线,R值为相关系数,R2=0.9859,表明曲线线性关系较好,具有可行性。以β-GP(-)组作为阴性对照,β磷酸甘油组干预后CCC-SMCs内CAN活力明显上升,P<0.05;以空白血清组作为阴性对照,显示维拉帕米组、全方组、拆方组干预后对CCCSMCs内CAN活性具有明显抑制作用,P<0.05。小结①全方组、拆方组及维拉帕米组含药血清均可明显抑制CCC-SMCs钙离子内流。②全方组、拆方组及维拉帕米组含药血清均可抑制CCC-SMCs内CAN活性。③温阳拆方组较全方组及维拉帕米组对CCC-SMCs钙离子内流的抑制作用明显。④温阳活血法可能通过抑制CCC-SMCs内CAN活性及钙离子内流预防和治疗动脉硬化性闭塞证。第二部分温阳活血法抑制高磷诱导的兔主动脉平滑肌细胞向成骨样细胞转化目的:探讨温阳活血法对高磷诱导的兔主动脉平滑肌细胞向成骨样细胞转化的影响。材料和方法:将兔主动脉平滑肌细胞(CCC-SMCs)分为6组:β-GP(-)组和β-GP(+)组、拆方组、全方组、维拉帕米组和空白血清组。各组细胞接受干预6d完成后,收集样本、立即进行微量酶标法测定ALP活性。各组含药血清干预细胞3d、6d、9d后,分别使用荧光定量PCR检测各组RUNX2及SMAD1 m RNA相对表达量。结果:微量酶标法测定兔主动脉平滑肌细胞内ALP活性,分析数据显示,以β-GP(-)组作为阴性对照,β磷酸甘油组干预后CCC-SMCs内ALP活力明显上升,P<0.05;以空白血清组作为阴性对照,显示维拉帕米组、全方组、拆方组干预后对CCC-SMCs内ALP活性具有明显抑制作用,P<0.05。实时荧光定量PCR各组提取的总RNA纯度和浓度均符合实验要求,基因RUNX2、SMAD1、GAPDH的溶解曲线为单峰,引物特异性强,无非特异性扩增和无目的基因的产物产生。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定荧光定量PCR扩增产物结果显示:各基因引物扩增RUNX2、SMAD1、GAPDH基因在各组CCC-SMCs中均有表达;扩增产物未出现数条条带或拖尾现象,说明引物特异性强,无非特异性扩增,无引物二聚体等无目的DNA产生;PCR产物的长度与对应目的基因的长度一致。使用2-△△CT法对各组样品中的RUNX2、SMAD1基因进行相对定量分析。实时荧光定量PCR结果显示,以β-GP(-)组作为阴性对照组进行比较,β-GP(+)组干预3d、6d、9d后RUNX2、SMAD1 m RNA的相对表达量水平均明显增高,P<0.05。全方组、拆方组、维拉帕米组以空白血清组为阴性对照,比较各组间含药血清干预3d RUNX2 m RNA的相对表达量均无明显差异(P>0.05),3d SMAD1m RNA的相对表达量全方组、拆方组、维拉帕米组3d的SMAD1 m RNA表达量均明显增高,P<0.05。6d后全方组、拆方组、维拉帕米组的RUNX2及SMAD1 m RNA表达量均明显下降,P<0.05。干预9d后,拆方组、维拉帕米组比较空白血清组RUNX2 m RNA的相对表达量均无明显差异,P>0.05;全方组比较空白血清组RUNX2 m RNA的相对表达量下降,P<0.05;9d后全方组、拆方组、维拉帕米组比较空白血清组的SMAD1 m RNA表达量均明显下降,P<0.05。小结①全方组、拆方组、维拉帕米组对CCC-SMCs内ALP活性均有抑制作用。②全方组、拆方组、维拉帕米组对RUNX2及SMAD1 m RNA的表达具有抑制作用。③、全方组、拆方组、维拉帕米组对RUNX2及SMAD1 m RNA的表达的抑制作用随时间改变。④、温阳活血法可能通过抑制CCC-SMCs内ALP活性以及RUNX2及SMAD1 m RNA的表达,抑制高磷环境中CCC-SMCs向成骨细胞分化和钙化。