《中华人民共和国药典》2020年版（一、四部）规定,中华蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）为蟾酥及蟾皮、干蟾等珍贵药材的基原动物之一,其隶属于两栖纲无尾目蟾蜍科蟾蜍属,并于2014年被正式列为国家“三有”动物。目前,中华蟾蜍基因相关研究鲜有报道,主要包括基因组分析及环境胁迫对基因表达的影响、活性成分生物合成等,对中华蟾蜍皮肤先天免疫分子机制的研究报道鲜少。本课题组前期对中华蟾蜍耳后腺、背部皮肤及腹部皮肤进行了转录组分析,挖掘出自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路（Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity）,该通路无需预先刺激,即可识别并杀死异常或感染细胞,在免疫监测癌症和病毒感染性疾病中发挥关键作用。前期研究从该通路中得到37个差异表达基因。本研究通过构建蛋白互作网络（Protein Protein Interaction,PPI）与查阅相关文献,从中筛选出RAC2、KRAS、MEK2及CD3Z基因作为研究重点。CD3Z基因在通路中位于RAC2、KRAS及MEK2基因上游,且在T细胞信号转导中具有关键作用;RAC2、KRAS、MEK2基因则均可参与细胞增殖、迁移、分化等多种细胞生理活动。本研究通过在HeLa细胞中过表达RAC2、KRAS、MEK2及CD3Z基因,初步探究RAC2、KRAS、MEK2及CD3Z基因互作关系及对HeLa细胞增殖与迁移的作用。本研究首先从NK细胞介导的细胞毒性通路中筛选出RAC2、KRAS、MEK2及CD3Z基因,克隆获得4个基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析与组织表达谱分析。qPCR结果显示,BgsRAC2、BgsCD3Z基因在肾脏中的相对表达量最高;BgsKRAS、BgsMEK2基因在肝脏、舌、心脏中的相对表达量最高。其次,通过分子克隆将BgsRAC2、BgsKRAS、BgsMEK2及BgsCD3Z基因构建在pEGFP-C1、pcDNA3.1（+）/myc-HisA载体上并测序验证。在HeLa细胞上转染真核表达重组质粒,均得到高表达,qPCR结果显示:pcDNA3.1（+）/myc-His A-BgsRAC2、pEGFP-C1-BgsRAC2 重组质粒转染组 RAC2 的mRNA水平分别约为空载组的12万倍、8万倍,并引起下游MEK2基因表达水平上调;pcDNA3.1（+）/myc-His A-BgsCD3Z转染组CD3Z的mRNA水平分别约为空载组的8.8万倍,并极显著上调下游RAC2基因的表达水平（P＜0.01）,同时上调下游KRAS基因的表达;pEGFP-C1-BgsKRAS转染组KRAS的mRNA水平约为空载组的9万倍,并引起下游MEK2基因表达水平上调;pcDNA3.1（+）1 A-BgsMEK2、pEGFP-C1-BgsMEK2转染组MEK2的mRNA水平分别为空载组的2千倍、6千倍。最后,利用细胞划痕实验、CCK-8法分别检测BgsRAC2、BgsKRAS、BgsMEK2及BgsCD3Z基因对HeLa细胞迁移能力、增殖能力的影响。结果显示:过表达BgsKRAS、BgsMEK2及BgsCD3Z基因均可促进HeLa细胞迁移,过表达BgsRAC2基因对HeLa细胞迁移能力无明显影响。中华蟾蜍BgsRAC2、BgsKRAS、BgsMEK2及BgsCD3Z基因过表达均能极显著促进HeLa细胞增殖（P＜0.01）。