中心碳代谢(central carbon metabolism,CCM)是生物体所需能量的主要来源,鉴于CCM在所有生命体中的重要作用,越来越受到重视。　　 本研究建立CCM关键氧化还原酶的高通量检测平台,并利用所建立平台对海洋微生物CCM进行研究。有别于传统研究微生物CCM的方法,本文着眼于CCM的氧化还原酶这一新视角,探讨海洋微生物CCM关键氧化还原酶活性对生长环境及培养时间的应答情况。本研究主要包括的内容和结果如下:　　 一、构建了海洋微生物中CCM关键氧化还原酶系的检测平台。本文选取Pseudomonas balearica和Pseudomonas beteli两株海洋菌作为研究对象,对其CCM中处于关键位置的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶以及异柠檬酸脱氢酶这6种氧化还原酶的检测条件进行研究,通过研究底物浓度、辅酶浓度、反应温度、反应缓冲液以及金属离子对酶活检测的影响,建立相对统一的CCM关键氧化还原酶系的高通量检测平台,即,缓冲液为60 mM的Tris-HCl(pH7.6),反应温度为35℃,反应体系中所含激活剂为10 mM的Mg2+。经过验证,该检测平台拥有良好的适应性及稳定性。　　 二、考察了在利用酶标仪进行酶活性测定时,微孔中传质及微孔板的内表面吸附酶蛋白对酶活测定的影响。本文通过测定在不同振荡条件下的酶活差异,考察传质对酶活测定的影响;通过测定不同比表面积下酶活差异,探讨吸附对酶活测定的影响。结果表明在不同振荡条件下,酶活差别较小,实验得到相对最佳的振荡条件为振荡频率600 rpm,持续时间90 s。吸附对酶活性检测影响明显,而且酶浓度较高时,该影响更为显著。对于相同酶而言,催化不同底物时,由于底物性质不同所导致的吸附影响差异较小。此外,微孔板内表面经过高吸附处理所产生的吸附影响比未经处理的略为明显。　　 三、高通量检测16株海洋微生物CCM中6种关键氧化还原酶。本文利用所建立的CCM关键氧化还原酶高通量检测平台,以源于不同生长环境的上述16株海洋微生物的中心碳代谢关键氧化还原酶为考察对象,基于酶活检测的数据,结合聚类分析及进化树,分析CCM关键氧化还原酶对菌株生长环境的应答。研究发现环境和地理因素会影响亲缘关系很近的菌株体内CCM途径的氧化还原酶的动态活性,这说明以往研究普遍认为亲缘关系较近的菌株其CCM相差无几的观点过于武断。　　 四、探讨了海洋微生物CCM关键氧化还原酶活性对培养时间的应答。本文从上述16株海洋微生物中选择源于中国北部湾沉积物的菌株Pseudomonasbalearica和Pseudomonas beteli作为例子进行考察,在考察各自生长动力学的同时,监测了各自CCM中前已述及的6种关键氧化还原酶的活性随培养时间变化的情形。综合比对分析发现,其三羧酸循环关键氧化还原酶2-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶及异柠檬酸脱氢酶在发酵初期皆保持较高的酶活。同时发现,菌株Pseudomonas beteli的粗酶液中MDH的活力高达60 U·mg-1。