目的：血小板活化因子(PAF)是迄今发现最强的血小板聚集剂及血管活性脂类递质，在重症急性胰腺炎(SAP)时胰腺局部损伤及全身微循环障碍的发生过程中起了举足轻重的作用。PAF在体内主要通过特异性的PAF受体(PAFR)将信号传递至细胞内来调节细胞的生命活动。PAFR属于七次跨膜的G蛋白偶联受体家族，活化后偶联于特异性的异三聚体G蛋白，开启胞内相应的信号转导通路。 异三聚体G蛋白由α、β和γ三种不同的亚单位组成，α亚单位(Gα)是功能性亚单位，决定G蛋白的活性，在G蛋白与受体及效应器的结合中起主要作用。根据Gα氨基酸序列同源性的不同将其分为Gαs、Gαi、Gαq、Gα12四类共二十余种亚型。PAFR主要与Gαq及Gαi等G蛋白α亚单位相偶联，产生第二信使将胞外信号转导至细胞核。另外，PAF也可以非受体依赖的将细胞外化学信号传递至胞内而发挥作用。迄今为止，Gα蛋白在胰腺组织的表达情况及PAFR在胰腺组织所偶联的Gα蛋白亚型，在国内外相关期刊尚未见报道。 PAF的特异性拮抗剂银杏苦内酯B(GinkgolideB，代号为BN52021)是从银杏叶中提取的萜内酯之一，可以竞争性的与PAFR相结合，而强烈抑制PAF的生理活性。BN52021用于实验性SAP的治疗也取得了良好的治疗效果，但其具体作用机制尚不明确。本研究用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BN52021对SAP大鼠胰腺组织Gαq、Gα11及Gαi2mRNA表达的影响，探讨G蛋白在SAP时PAF信号转导过程中的作用以及BN52021应用于SAP的治疗机制。 方法：1.实验对象与分组：Wistar大鼠180只，体质量180g～220g，随机分为正常对照组(NC，n=60)，SAP组(SAP，n=60)及BN52021治疗组(BN,n=60)，每组再分为6个时相点(1h、2h、3h、6h、12h、24h)，各组10只。 2.模型制备与标本采取：大鼠称重，标记，术前24h禁食，自由饮水。0.4％戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔注射麻醉。仰卧位固定后，备皮、消毒、铺无菌巾，于上腹正中做2cm切口进入腹腔。找到大鼠的十二指肠和胆胰管后，用无创血管夹夹住胆胰管肝端，用钝头针头经十二指肠浆肌层行胆胰管逆行穿刺术。穿刺成功后，微量注射器逆行胆胰管注射5％牛磺胆酸钠(1mL·kg-1)，推注速度0.24mL·min-1。推药后用无创血管夹夹住胆胰管入十二指肠处，观察10min，去除血管夹，确认腹腔内无活动性出血后，两层关腹并用无菌纱布覆盖伤口，NC组开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次关腹。术后BN组股静脉注射BN52021(5mg·kg-1)，NC组、SAP组股静脉注射等量生理盐水。各组分别在处理后1h、2h、3h、6h、12h、24h麻醉并开腹，迅速采集心脏血液和胰腺组织。采用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶。胰腺组织，一部分立即以冰冷的无RNA酶水冲洗后置于冰上以50～100mg分装，随即投入液氮速冻，-80℃超低温冰箱妥善保存；另一部分以中性缓冲甲醛固定(40g·L-1)，石蜡包埋切片后HE染色制片，观察胰腺组织的病理学变化。 3.总RNA提取与质量检测：从超低温冰箱取出胰腺组织样本放入预冷的研钋，迅速加入液氮研磨成粉末，转入匀浆器，加入冰冷的Trizol试剂1mL,充分匀浆。随后在无菌操作台内将匀浆液转移到一1.5mL无RNA酶离心管中。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30sec。15～30℃放置5min，12,000rpm，2～8℃离心15min。将上清液小心转移到另一1.5mL无RNA酶离心管内，加入0.5mL的异丙醇，15～30℃放置10min，2～8℃，12,000rpm，离心10min。小心移去上清液，用75％酒精洗涤沉淀两次，每次1mL，7,500rpm，2～8℃离心5min。尽可能彻底地吸走上清，无菌操作台内室温空气干燥5～10min，使酒精完全挥发。沉淀用30～50μL无RNA酶水溶解后置于-80℃超低温冰箱妥善保存。测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量，计算RNA的产率和污染情况。1％琼脂糖电泳，确定RNA的完整性。 4.RT-PCR：将纯度高且完整性良好的总RNA样本用随机引物oligo(dT)逆转录合成cDNA。使用PrimerPremier5.0设计Gαq、Gα11及Gαi2的特异性引物，对cDNA进行经典PCR扩增。同时扩增管家基因β-actin，作为定量基因表达的内部参照。扩增体系为30μL，热循环条件如下：94℃变性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸lmin，共35个循环。每次PCR反应都取一管以等量去离子x水取代cDNA作为阴性对照同时扩增，以控制DNA污染。扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描摄片后，通过检测光密度值对Cαq、Gα11及Gαi2mRNA的表达情况进行半定量。 结果：1.Gαq、Gα11及Gαi2在大鼠正常胰腺组织均有表达。三者在制模后不同时间均出现表达水平的显著变化。 2.SAP时，Gαq的表达增高最为迅速，在制模后1h即出现一个表达高峰(t=-3.240，P=0.025)，随即有所下降，到6h时表达又显著上调(t=-3.839，P=0.018)，且这种上调可被BN52021所抑制(t=-4.041，P=0.008)。 3.Gα11的表达水平在SAP发病后2h即有升高(t=-3.845，P=0.019)，3h时出现表达高峰(t=-4.067，P=0.005)，BN52021治疗对该表达的上调没有产生显著的抑制作用，却在制模后24h,促进了该基因的表达(t=2.722，P=0.036)。 4.制模后12hGαi2表达水平才有上调(t=-7.213，P=0.000)，而且这种上调持续到24h以后(t=-8.597，P=0.000)，BN52021治疗未改变这种上调趋势。 结论：1.Gαq、Gα11及Gαi2均有可能参与了SAP的发病过程。 2.Gαq与Gα11参与了SAP时PAF的信号转导。但二者所起的作用却并不相同。Gαq是PAF信号在SAP发病过程中的主要递质，开启了PAF的G蛋白信号通路。而在SAP晚期，PAF抑制了与Gαq生理功能相似的Gα11的表达，同时抑制了其信号通路，在一定程度上负性调节了Gαq所起的作用。这可视为体内的一种自我调节。 3.在SAP发病中，Gαi2与PAF信号转导通路的关系尚不明确。一方面它在SAP发病过程中的表达上调有可能是由其它致病因素而非PAF所引发的；另一方面，可能Gαi2也参与了PAF的信号转导过程，但由于其在SAP时的上调发生较迟，在本课题研究的24h以内，BN52021所起的作用尚未显著的表现出来。 4.在SAP发病早期(24h以内)，BN52021主要通过结合于PAFR抑制Gαq的表达上调而发挥了对SAP的治疗作用。