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外泌体是指一类富含RNA和蛋白质的小囊泡,直径在30~100nm之间。本研究主要是对肝癌细胞HepG2细胞的外泌体进行分离提取和鉴定,并观察肿瘤细胞自身外泌体对其细胞增殖、迁移以及细胞周期和甲基化水平的影响,并尝试探讨其机制。采用的主要方法包括用超速差速离心法对收集的肝癌细胞HepG2的培养上清液进行超速差速离心,提取细胞外泌体;采用透射电子显微镜,纳米粒度分析,BCA法进行外泌体浓度定量检测及外泌体膜标志蛋白检测对提取的外泌体进行鉴定;通过倒置荧光显微镜观察肝癌细胞HepG2对DiI红色荧光探针标记的肿瘤外泌体的摄取情况;用划痕实验检测自身外泌体处理过的细胞增殖迁移能力;用transwell实验来观察肿瘤自身外泌体对肿瘤细胞的迁移侵袭能力;流式细胞术分析肿瘤外泌体对肝癌细胞HepG2的细胞周期的影响;直接免疫荧光法检测肿瘤外泌体对肝癌细胞HepG2的甲基化水平影响;用实时荧光PCR检测肿瘤外泌体处理后肝癌细胞HepG2的细胞周期相关基因CyclinD、CKS1和甲基化转移酶DNMT3A、DNMT3B、DNMT1以及凋亡相关基因Bax、BcI-2的转录的影响。对提取后的外泌体进行鉴定,电子透射显微镜下可见提取成功的外泌体囊泡,纳米粒度分析仪检测提取的肝癌细胞HepG2培养上清中的外泌体大小均在30-100nm之间,western blot检测外泌体膜标志蛋白CD63和CD9的条带,证明提取成功;倒置荧光显微镜下观察到DiI红色荧光探针标记的肿瘤外泌体可以被HepG2细胞摄取,红色荧光均分布于核周或核上;划痕实验结果表明,经肝癌细胞HepG2培养上清外泌体处理过的肝癌HepG2细胞迁移能力明显增强,transwell实验结果表明,肝癌细胞HepG2外泌体对肿瘤细胞的迁移侵袭能力有显著提升;流式细胞术结果表明,肝癌细胞HepG2外泌体处理过的HepG2细胞的细胞周期G1期缩短;免疫荧光染色法检测肝癌细胞HepG2外泌体处理后的肿瘤细胞的绿色荧光强度升高,甲基化水平明显增强;实时荧光PCR结果表明,经肝癌细胞HepG2培养上清中的外泌体处理后,HepG2细胞周期相关基因CyclinD、CKS1均上调,与对照组相比,差异显著(P<0.05),甲基转移酶基因DNMT3A、DNMT3B转录水平显著提高,与对照组相比,差异显著(P<0.05),DNMT1转录水平轻微下降,而Bax转录水平显著提高(P<0.05),BcI-2的相对表达量显著降低趋近于不表达(P<0.05)。通过结果可以得出结论,肝癌细胞HepG2细胞的外泌体可以在体外改变DNMT3A、DNMT3B基因的转录水平及其甲基化水平,肝癌细胞HepG2细胞的外泌体可以调控某些基因表达如Bax、BcI-2,进而抑制细胞凋亡并促进增殖能力;可以在体外通过对CyclinD、CKS1等细胞周期基因调高来缩短其细胞周期,从而对肿瘤细胞自身的增殖、迁移起促进作用。