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背景阿尔茨海默病（Alzheimersdisease，AD）一种常见的中枢神经系统退行性疾病，以患者脑组织中淀粉样斑块沉积、神经元纤维缠结和相关炎症反应等为特点，但其发病机制仍未阐明。神经细胞黏附分子L1（L1CAM）参与神经干细胞的分裂、分化、迁移以及神经系统发育等重要过程。神经调节蛋白（Neuregulin，Nrg）是类表皮生长因子家族重要成员。Nrg信号通路介导神经发育、再生等重要生理过程,且有研究显示处于发育阶段和成年大脑的L1和Nrg1的功能部分类似。
目的通过一系列体内和体外实验探究在AD病理发生发展过程中，L1和Nrg1信号通路的变化情况，以及L1调控Nrg1信号通路在抗Aβ治疗中的作用，为AD的发病和治疗机制研究提供参考。
方法1.利用免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）染色和蛋白免疫印迹法（westernblot）分别检测野生型（WT）和APPswe（Tg）转基因小鼠前额叶皮质（PFC）和海马（HIP）脑区L1、Nrg1以及Nrg1相关受体ErbB4的磷酸化激活的变化情况；2.利用Tg小鼠与L1+/-小鼠杂交得到Tg/L1+/-小鼠，使用IHC，IF和westernblot检测不同脑区L1、Nrg1以及Nrg1相关受体ErbB4的磷酸化激活的变化情况；3.Tg小鼠腹腔注射重组L1（rL1），使用IHC，IF和westernblot检测脑组织中L1、Nrg1和Nrg1受体ErbB4的磷酸化改变；4.取16～18天胎鼠皮质和海马组织进行原代培养，实验分8组：1）溶剂对照（vehiclecontrol），2）L1，3）Nrg1，4）Ng1+L1，5）Aβ1-42，6）Aβ1-42+L1，7）Aβ1-42+Nrg1和8）Aβ1-42+L1+Nrg1组，采用细胞IF双标法检测神经元中Nrg1受体ErbB4的磷酸化激活的变化情况。
结果
1.IHC染色显示与同龄WT小鼠相比，9月龄Tg小鼠PFC可见阳性β-淀粉样斑块沉着，L1及Nrg1阳性信号未见明显改变。IHC及IF研究结果表明，pErbB4阳性信号亦未见明显变化。Westernblot研究表明，与WT小鼠相比，Tg小鼠前额叶皮质L1、Nrg1各亚型以及pErbB4水平均未见显著变化。免疫组织化学染色显示与同龄WT小鼠相比，9月龄Tg小鼠HIP脑区亦可见少量Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着，海马CA1及齿状回（dentategyrus,DG）脑区L1及Nrg1阳性信号未见明显改变。IHC及IF研究结果表明，海马CA1及DG区pErbB4阳性信号略有降低。Westernblot结果表明，与WT小鼠相比，Tg小鼠海马L1略增高、Nrg1各亚型中70kDa亚型水平升高，其余亚型水平变化不明显，pErbB4水平略下降，但均未见显著变化。
2.免疫组织化学染色显示与同龄WT小鼠相比，12月龄Tg小鼠PFC可见大量Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着，L1及Nrg1阳性信号增强，在淀粉样斑块沉着区域亦可见Nrg1阳性信号。IHC及IF研究结果表明，pErbB4阳性信号亦未见明显增高。Westernblot研究表明，与WT小鼠相比，前额叶皮质L1水平增高，Nrg1各亚型及pErbB4水平明显下降（与WT组相比，**p<0.01）。免疫组织化学染色显示与同龄WT小鼠相比，12月龄Tg小鼠HIP脑区Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着显著增多，CA1及DG脑区L1信号略降低，Nrg1阳性信号略增强，并部分位于淀粉样斑块沉着区域。IHC及IF研究结果表明，CA1及DG区pErbB4阳性信号略有降低。Westernblot结果表明，与WT小鼠相比，Tg小鼠海马L1水平略有降低、Nrg1各亚型中70kDa亚型水平降低，55kDa亚型水平升高，其余亚型水平未见明显改变；pErbB4水平显著降低（与WT组相比，**p<0.01）。
3.免疫组织化学染色显示与同龄Tg小鼠相比，24月龄Tg/L1+/-小鼠PFC中Aβ42阳性β-淀粉样斑块聚集程度增加，且面积较大斑块数量增多；L1及Nrg1阳性信号强度均有所下降。IHC及IF研究结果表明，pErbB4阳性信号亦有所降低。IHC染色显示，与同龄Tg小鼠相比，24月龄Tg/L1+/-小鼠HIP脑区Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着增多，CA1及DG脑区L1信号略降低，Nrg1阳性信号略增强；IHC及IF研究结果表明，CA1及DG区pErbB4阳性信号略有降低。
4.IHC染色显示，与给予生理盐水作为溶剂对照的Tg小鼠相比，连续给药rL114天后，PFC中Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉积减少，与斑块结合的Nrg1阳性信号强度降低；pErbB4阳性信号亦有所降低。在海马CA1及DG区，IHC染色显示，与给予生理盐水作为溶剂对照的Tg小鼠相比，连续给药rL114天后，Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉积一定程度减少，Nrg1信号强度略增强；IHC及IF检测均未见pErbB4信号增强。
5.在原代培养皮质神经元，IF双标法研究表明，与溶剂对照组相比，单独给予rL1、Nrg1以及两者联合给药均可一定程度上增加pErbB4水平；Aβ42也可增加原代培养皮质神经元中pErbB4水平，在给予Aβ42的同时分别给予rL1或Nrg1，不能增加pErbB4水平，而rL1与Nrg1联合给药则可进一步促进pErbB4水平增高。在原代培养海马神经元，IF双标法研究表明，与溶剂对照组相比，单独给予rL1、Nrg1以及两者联合给药均可一定程度上增加pErbB4水平，以rL1作用最为显著；给予Aβ42处理海马神经元后，pErbB4水平明显降低，在给予Aβ42的同时分别给予rL1或Nrg1，均可一定程度增加pErbB4水平，逆转Aβ42对HIP神经元ErbB4激活的抑制，而rL1与Nrg1联合给药则可进一步促进pErbB4水平增高。
结论本实验研究结果表明1）AD发生发展过程中，伴随有L1和Nrg1及其受体ErbB4的磷酸化激活的改变，L1/Nrg1信号通路变化参与了AD病理生理过程；2）L1可能通过影响Nrg1信号通路参与AD病理条件下神经元保护，进一步提示L1和Nrg1联合给药可能为AD预防和治疗提供重要参考。
目的通过一系列体内和体外实验探究在AD病理发生发展过程中，L1和Nrg1信号通路的变化情况，以及L1调控Nrg1信号通路在抗Aβ治疗中的作用，为AD的发病和治疗机制研究提供参考。
方法1.利用免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）染色和蛋白免疫印迹法（westernblot）分别检测野生型（WT）和APPswe（Tg）转基因小鼠前额叶皮质（PFC）和海马（HIP）脑区L1、Nrg1以及Nrg1相关受体ErbB4的磷酸化激活的变化情况；2.利用Tg小鼠与L1+/-小鼠杂交得到Tg/L1+/-小鼠，使用IHC，IF和westernblot检测不同脑区L1、Nrg1以及Nrg1相关受体ErbB4的磷酸化激活的变化情况；3.Tg小鼠腹腔注射重组L1（rL1），使用IHC，IF和westernblot检测脑组织中L1、Nrg1和Nrg1受体ErbB4的磷酸化改变；4.取16～18天胎鼠皮质和海马组织进行原代培养，实验分8组：1）溶剂对照（vehiclecontrol），2）L1，3）Nrg1，4）Ng1+L1，5）Aβ1-42，6）Aβ1-42+L1，7）Aβ1-42+Nrg1和8）Aβ1-42+L1+Nrg1组，采用细胞IF双标法检测神经元中Nrg1受体ErbB4的磷酸化激活的变化情况。
结果
1.IHC染色显示与同龄WT小鼠相比，9月龄Tg小鼠PFC可见阳性β-淀粉样斑块沉着，L1及Nrg1阳性信号未见明显改变。IHC及IF研究结果表明，pErbB4阳性信号亦未见明显变化。Westernblot研究表明，与WT小鼠相比，Tg小鼠前额叶皮质L1、Nrg1各亚型以及pErbB4水平均未见显著变化。免疫组织化学染色显示与同龄WT小鼠相比，9月龄Tg小鼠HIP脑区亦可见少量Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着，海马CA1及齿状回（dentategyrus,DG）脑区L1及Nrg1阳性信号未见明显改变。IHC及IF研究结果表明，海马CA1及DG区pErbB4阳性信号略有降低。Westernblot结果表明，与WT小鼠相比，Tg小鼠海马L1略增高、Nrg1各亚型中70kDa亚型水平升高，其余亚型水平变化不明显，pErbB4水平略下降，但均未见显著变化。
2.免疫组织化学染色显示与同龄WT小鼠相比，12月龄Tg小鼠PFC可见大量Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着，L1及Nrg1阳性信号增强，在淀粉样斑块沉着区域亦可见Nrg1阳性信号。IHC及IF研究结果表明，pErbB4阳性信号亦未见明显增高。Westernblot研究表明，与WT小鼠相比，前额叶皮质L1水平增高，Nrg1各亚型及pErbB4水平明显下降（与WT组相比，**p<0.01）。免疫组织化学染色显示与同龄WT小鼠相比，12月龄Tg小鼠HIP脑区Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着显著增多，CA1及DG脑区L1信号略降低，Nrg1阳性信号略增强，并部分位于淀粉样斑块沉着区域。IHC及IF研究结果表明，CA1及DG区pErbB4阳性信号略有降低。Westernblot结果表明，与WT小鼠相比，Tg小鼠海马L1水平略有降低、Nrg1各亚型中70kDa亚型水平降低，55kDa亚型水平升高，其余亚型水平未见明显改变；pErbB4水平显著降低（与WT组相比，**p<0.01）。
3.免疫组织化学染色显示与同龄Tg小鼠相比，24月龄Tg/L1+/-小鼠PFC中Aβ42阳性β-淀粉样斑块聚集程度增加，且面积较大斑块数量增多；L1及Nrg1阳性信号强度均有所下降。IHC及IF研究结果表明，pErbB4阳性信号亦有所降低。IHC染色显示，与同龄Tg小鼠相比，24月龄Tg/L1+/-小鼠HIP脑区Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉着增多，CA1及DG脑区L1信号略降低，Nrg1阳性信号略增强；IHC及IF研究结果表明，CA1及DG区pErbB4阳性信号略有降低。
4.IHC染色显示，与给予生理盐水作为溶剂对照的Tg小鼠相比，连续给药rL114天后，PFC中Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉积减少，与斑块结合的Nrg1阳性信号强度降低；pErbB4阳性信号亦有所降低。在海马CA1及DG区，IHC染色显示，与给予生理盐水作为溶剂对照的Tg小鼠相比，连续给药rL114天后，Aβ42阳性β-淀粉样斑块沉积一定程度减少，Nrg1信号强度略增强；IHC及IF检测均未见pErbB4信号增强。
5.在原代培养皮质神经元，IF双标法研究表明，与溶剂对照组相比，单独给予rL1、Nrg1以及两者联合给药均可一定程度上增加pErbB4水平；Aβ42也可增加原代培养皮质神经元中pErbB4水平，在给予Aβ42的同时分别给予rL1或Nrg1，不能增加pErbB4水平，而rL1与Nrg1联合给药则可进一步促进pErbB4水平增高。在原代培养海马神经元，IF双标法研究表明，与溶剂对照组相比，单独给予rL1、Nrg1以及两者联合给药均可一定程度上增加pErbB4水平，以rL1作用最为显著；给予Aβ42处理海马神经元后，pErbB4水平明显降低，在给予Aβ42的同时分别给予rL1或Nrg1，均可一定程度增加pErbB4水平，逆转Aβ42对HIP神经元ErbB4激活的抑制，而rL1与Nrg1联合给药则可进一步促进pErbB4水平增高。
结论本实验研究结果表明1）AD发生发展过程中，伴随有L1和Nrg1及其受体ErbB4的磷酸化激活的改变，L1/Nrg1信号通路变化参与了AD病理生理过程；2）L1可能通过影响Nrg1信号通路参与AD病理条件下神经元保护，进一步提示L1和Nrg1联合给药可能为AD预防和治疗提供重要参考。