血管紧张素转换酶2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）作为血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System,RAS）的重要一员,自2000年被发现以来,其病理生理功能,特别是作为SARS、SARS-coV-2等冠状病毒侵入细胞的功能性受体显示了巨大的研究潜能,但鸡ACE2方面的相关研究尚未开展。本研究以白羽肉鸡为研究对象,对鸡ACE2基因进行了克隆,建立鸡ACE2原核和真核表达体系,制备其多克隆抗体,并获得ACE2活性蛋白。研究包括以下三个方面:1.鸡血管紧张素转换酶2（ACE2）的基因克隆及序列的生物信息学解析以白羽肉鸡为研究对象,首先通过RT-PCR和Western blot明确鸡体内有无ACE2基因和蛋白存在。然后从白羽肉鸡空肠组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到pMD-19T载体并转到大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行蓝白斑筛选,菌液PCR、酶切及测序验证。对所得序列进行生物信息学解析。结果:1)明确了 ACE2在白羽肉鸡体内有存在,分布表达有组织特异性。2)成功克隆了白羽肉鸡ACE2基因编码区全序列,共含2444个核苷酸,编码808个氨基酸残基。同源性比较发现,该鸡ACE2基因核苷酸序列与红原鸡ACE2预测序列同源性最高为99%,与人最低仅为50%。遗传进化分析发现该ACE2基因与家猪的遗传距离最近,与牛羊处在两个不同的分支上,与鸡在其他基因遗传进化上的规律相符。3)生物信息学解析发现:该ACE2基因编码蛋白属不稳定、亲水性蛋白,蛋白信号肽序列位于第1-17aa之间,蛋白跨膜螺旋预测为Ⅰ型跨膜蛋白。细胞内分布主要在细胞膜、内质网和细胞质。整条多肽链共有87个磷酸化位点,其中丝氨酸37处、苏氨酸32处,酪氨酸18处。该鸡ACE2蛋白不存在O-糖基化位点,主要是N-糖基化位点。对人的与SARS病毒S蛋白结合有关的18个关键氨基酸残基比较分析发现,该白羽肉鸡ACE2除第330和353位氨基酸与人的ACE2一样外,其它16个氨基酸均不一致。本实验首次成功克隆了肉鸡ACE2编码区全基因序列,并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,所得序列已上传GenBank,基因序列号为MK560199。2.鸡血管紧张素转换酶2（ACE2）的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定采用上一章获得的pMD19T-ACE2质粒,酶切、回收目的片段,将纯化的目的片段与经过双酶切的原核表达载体pET32a酶切连接,构建原核表达载体pET32a-ACE2,将连接产物转化到感受态细胞,挑选单克隆菌落,经过PCR和酶切验证后测序。对测序正确的单克隆菌落,用IPTG诱导ACE2蛋白表达并优化诱导条件,确定其表达方式。表达蛋白经KCL染色切胶纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定其特异性和分子量,管式凝胶等电聚焦电泳（IEF-PAGE）确定其pI。利用纯化后的pET32a-ACE2表达的重组ACE2蛋白作为抗原免疫大鼠,免疫4周,抗体判定结果均为阳性后宰杀大鼠,分离血清获得鼠抗ACE2多克隆抗体。间接ELISA法测定抗体效价,确定所制备抗体的最佳包被浓度和最佳稀释度;Western blot、免疫组化及细胞免疫荧光法检测其特异性及细胞内定位。结果:1)成功构建了 pET32a-ACE2原核表达载体,诱导获得了 pET32a-ACE2重组蛋白,并优化了重组蛋白诱导表达的最佳条件为:IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为10h。该ACE2重组蛋白主要以包涵体的形式表达在菌体沉淀中。2)KCL染色切胶纯化获得了具有较好特异性的鸡源ACE2重组蛋白;该鸡源ACE2重组蛋白为单链蛋白,分子量约为105kDa,pI为5.01。3)成功制备了鼠抗鸡源ACE2多克隆抗体。经间接ELISA方法确定该抗原最佳包被浓度为1.6ug/mL,所得鼠抗ACE2血清均为免疫阳性,抗体效价为1:400;Western blot分析表明制备的该鼠抗ACE2多克隆抗体在鸡组织中有单一 ACE2蛋白条带出现,但在其它动物上条带较弱或没有;免疫组化检测在鸡肺脏、十二指肠、睾丸等均有ACE2蛋白的阳性分布,也间接证明了该制备抗体的特异性。免疫荧光结果显示该ACE2蛋白在LMH细胞中有表达,并大多分布在细胞膜上。结论:实验成功构建了鸡pET32a-ACE2原核表达载体,获得了具有良好抗原性和特异性的鸡ACE2重组蛋白,并对蛋白的理化性质进行了初步研究。通过克隆、表达、多次免疫成功获得鸡ACE2多克隆抗体,该抗体具有良好效价和特异性,可用于ACE2在白羽肉鸡及禽类方面的进一步的研究。3.鸡血管紧张素转化酶2（ACE2）真核表达体系的建立及稳定细胞系的筛选本章旨在构建稳定的鸡ACE2真核表达细胞系,获得具有ACE2活性的活性蛋白,为后续研究奠定基础。研究采用白羽肉鸡空肠组织进行如下实验:1)RT-PCR扩增出鸡ACE2编码区序列,酶切鉴定正确后,以同源重组方式连接ACE2基因片段到pcDNA3.1（+）真核表达载体,经菌液PCR、酶切及测序鉴定后,以脂质体方法转染至CHO细胞,经G418初步筛选后再经单克隆进一步筛选,使重组质粒能在CHO细胞中稳定表达;2)RT-PCR,Western blot及免疫荧光法检验ACE2基因在CHO细胞中的表达或转染情况;3)双抗体夹心法测定ACE2活性蛋白的酶活性。结果:1)体外成功构建了 ACE2真核表达载体pcDNA3.1（+）-ACE2;经单酶切出现7872bp片段,测序鉴定结果与预期完全一致;2)重组载体pcDNA3.1（+）-ACE2成功转染至CHO细胞,RT-PCR结果显示在CHO细胞中有较高的mRNA表达;免疫荧光结果显示pcDNA3.1（+）-ACE2重组蛋白均匀分布在细胞膜上,且有高的转染效率;Western blot结果显示pcDNA3.1（+）-ACE2重组蛋白在CHO细胞中有较高表达,蛋白大小为105 kDa左右;3)成功筛选出4株能稳定表达ACE2蛋白的细胞株,分别命名为pcDNA3.1（+）-ACE2-A、pcDNA3.1（+）-ACE2-B、pcDNA3.1（+）-ACE2-C 和 pcDNA3.1（+）-ACE2-D;4)双抗体夹心法的测定结果表明CHO细胞中提取的ACE2蛋白酶活性为601.77U/L,酶活性较高。本实验获得了具有生物学活性的ACE2蛋白,为后续探究鸡ACE2的生物学作用研究奠定了基础。