高通量测序技术及生物信息学的发展使得越来越多的海洋微生物新类群被发现和认识,但想要深入研究海洋微生物的生理生化功能,及其在海洋生态系统中的作用,仍然需要培养这些微生物,分析其形态结构到表型特征。前期本实验室建立了较为完整的富集分离培养流程,对其系统研究发现富集培养过程中微生物间存在较复杂的相互作用,且富集培养法能够从海洋沉积物中高效分离未培养的微生物,但是如何利用富集过程微生物间的相互作用提高富集后微生物的分离培养目前尚不得而知,这阻碍了对富集培养方法的深入研究与应用。本次研究我们利用16S rRNA基因高通量测序和靶向代谢组学技术,围绕着富集培养过程中与难培养细菌类群显著相关的关键代谢物,开展对海洋难培养微生物的分离培养研究。本论文首次使用代谢组学方法研究富集培养过程中微生物群落变化相关的生物因子,以期发现新型的促进难培养微生物分离培养的生物因子。主要的研究结果如下:(1)16S rRNA基因高通量测序技术对不同富集时期细菌群落结构变化分析。结果显示,XSDO时期微生物多样性最好,随着富集培养的进行,微生物的多样性逐渐降低;经过富集培养后部分微生物类群的相对丰度急剧增长,如Clostridiales、Marinilabiliales、Fusobacteriales、Spirochaetales、Desulfovibrionales、Synergistales和Desulfobacterales。(2)基于靶向代谢组学对不同富集时期培养液的胞外代谢物进行分析。共检测到 43 种代谢物,4-Pyridoxic acid、Adenine、5-Aminopentanoic acid、Pyridoxic acid、SCFA等在富集培养过程中含量发生显著变化,主要涉及辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、SCFA代谢、氨基酸代谢、信号转导通路等途径。进一步分析发现,SCFA类代谢物随着富集培养的进行,含量显著提高,且与多种难培养细菌类群存在显著相关性。(3)优化培养条件和培养基营养组分,对富集培养液中可培养细菌进行分离培养及基因组比较分析。采用厌氧培养条件,同时对实验组培养基的营养组分进行优化(添加SCFA类化合物)。共分离得到444株菌,CK组分离得到206株菌,属于6个门,31个科,69个物种,潜在新菌14株,16S rDNA相似度低于90%的菌株0株;实验组分离得到238株菌,属于10个门,26个科,82个物种,潜在新菌50株,16S rDNA相似度低于90%的菌株8株。实验组显著提高了可培养细菌的多样性及潜在新菌数量,且CK组与实验组分离得到的细菌类群差异较大。基因组代谢途径分析发现大多数从实验组分离得到的潜在新菌其SCFA的生物合成途径不同程度缺陷,但具有一定SCFA氧化降解能力。(4)完成一株海洋厌氧菌的多相分类。通过对表型特征、基因组比较、系统发育等多种方法的比较分析,确定菌株S-5007T的分类地位。它代表了Kiritimatiellaeota门的一个新纲,建议命名为中华球菌纲(Chinicoccuse classis.nov.),同时代表中华球菌纲的一个新物种,命名为耐氧中华球菌(Chinicoccus aerotolerans gen.nov.,sp.nov.),模式菌种为 S-5007T(=MCCC 1H00402T=KCTC 15876T)。