精子超活化运动是精子获能和发生顶体反应的一个重要生理前提,其赋予精子强有力运动,使其逃离输卵管上皮“诱捕”,成功穿越透明带与卵子结合完成受精。先前的研究包括本课题组已经证实,在众多质膜离子通道中,Cation channel of sperm (CatSper)蛋白家族所介导的Ca2+直接参与精子超活化的调控过程。作为介导Ca2+专一性通道蛋白,CatSper蛋白家族与精子超活化和受精力直接相关[62,63],且其专一性表达于睾丸和成熟的精子。过去的几年中,对于对CatSper家族的研究主要是集中于对其功能的探讨,尚未见以其为靶点进行雄性生殖调控的研究,可以预见在现有对CatSper家族蛋白研究基础上,抑制或敲减CatSper家族蛋白某个亚基的表达,探讨雄性生殖调控的最佳靶点将成为未来CatSper家族蛋白研究的重点。本研究针对大鼠CatSper蛋白家族的一个亚基CatSper2构建质粒载体和病毒载体,借助睾丸网微注射和活体电转等措施转染大鼠睾丸,以期通过阻断大鼠精子胞外Ca2+峰,抑制精子超活化过程,而实现对雄性生殖调控的目的。研究中,分别利用小动物活体成像系统、荧光解剖镜、FCM、CASA、Q-PCR、Western-blot、激光共聚焦显微镜、IVF和组织学分析等手段,对活体干涉后大鼠睾丸组织和附睾精子的转染效率、精子超活化运动、CatSper2表达敲减率、精子胞内Ca2+震荡波、精子受精能力、体外存活时间,以及睾丸网微注射和活体电转等可能对睾丸功能和精子生理机能产生的影响等问题分别进行了系统分析。主要研究结果如下：1.成功构建了大鼠CatSper2基因的质粒载体和病毒载体,并在大鼠活体睾丸实现了高效转染和表达；根据体外电穿孔介导siRNA转染精子筛选出的最佳干涉序列,实验成功构建了CatSper2基因质粒载体和病毒载体,并借助睾丸网微注射和活体电转的手段在大鼠活体获得了良好转染和高效表达效果。相比于病毒载体的持续稳定表达,质粒载体结合活体电转的方法在对CatSper2基因的敲减方面更加有优势。反过来,就转染后大鼠附睾阳性精子率来讲,尽管质粒载体组87.75%略高于病毒组的83.3%(P>0.05),但在转染后第60d获得附睾阳性精子率,病毒组的78.7%略高于质粒组的77.75%(P>0.05),并且在两者对CatSper2蛋白的敲减持续性方面,病毒组同样优于质粒组。这表明病毒重组质粒能够对宿主细胞获得更好的整合性。但是两者之间的这些数据之间并不具有统计学差异。2、生理状态下,质粒载体和病毒载体对睾丸的转染和表达效率存在强的浓度和时间依赖性；通过小动物活体成像系统和荧光解剖镜的分析可以知道,随着质粒载体(25μg～50μg)和病毒载体(10μl～40μl)主射剂量的增大,睾丸表面所捕获的GFP荧光信号及观察到荧光表达逐渐增强,呈现明显的浓度依赖性,注射50μg质粒载体和40μl病毒液时获得了最强的GFP表达信号。但在对数据分析后表明,对于质粒载体注射45μg和50μg睾丸GFP信号强度并没有显著差异(P>0.05)；在病毒转染组注射35μl和40μl病毒液时两者睾丸GFP表达也没有统计学差异,为了获得更好的实验结果,后续的实验中均以注射45μg质粒载体和35μl病毒载体进行相关的研究；从实验的结果知道,当注射同等剂量的质粒载体和病毒液时,两者转染效率同样存在显著的时间依赖性,质粒载体和病毒载体对睾丸组织和附睾精子CatSper2表达敲减的峰值均出现在了转染后第13天和第22天。3、活体干涉后大鼠附睾精子CASA分析显示,精子胞内储存Ca2+足够起始超活化过程,但没有胞外峰的支持,超活化过程将无法维持；当应用50μM thimerosal处理大鼠的精子时,无论胞外环境中是否存在Ca2+,90%以上的处理组和对照组精子都能够发生超活化过程,只不过这一过程非常短暂；之后如果将精子在含有5mM procaine获能液中孵育5mmin,相比于对照组90%以上的精子再次获得超活化不同,干涉处理组精子却因为质膜上没有更多的CatSper2通道蛋白响应procaine的激活,无法介导更多的Ca2+峰的进入胞质,精子细胞内持续处于较低Ca2+浓度的状态,这表明尽管细胞内储存Ca2+足够起始超活化过程,但如果没有胞外Ca2+峰的有效补充超活化过程将无法得以维持。4.CatSper2表达敲减后,精子胞内Ca2+峰的缺失,使精子丧失穿越透明带的能力无法完成受精；体外受精实验证实,干涉处理组大鼠附睾精子由于缺少一种穿越透明带的“力量”而不能像对照组一样使正常卵子受精。相反,以0.4%透明质酸酶将透明带去除后的卵子却能与干涉处理组精子正常受精,并且受精率并没有显著差异；为了更进一步揭示干涉处理组精子无法使正常卵母细胞受精的真正原因,我们又进行粘滞性溶液中精子迁移率的实验,相对于对照组和Mock组精子前进行性运动下降为正常状态的48%,病毒转染处理组精子前进行性几乎完全被抑制。这也进一步表明阻碍干涉处理组精子无法完成受精的主要原因是,透明带粘滞性环境对丧失超活化运动的大鼠精子是最大的障碍。5、睾丸组织学和精子体外存活研究证实,睾丸网微注射和活体电转的处理并没有大鼠睾丸功能和精子本身产生有害影响。睾丸微注射结合活体电转介导质粒转染睾丸,通过敲减CatSper2基因表达探索雄性生殖调控的最佳靶点,最重要的是要保证睾丸功能和精子的产生及其功能没有受到影响。为了证实这些方法可能的副作用,我们对睾丸网微注射和活体电转后大鼠的睾丸组织和精子体外存活率等指标进行了分析,从图4-6结果知道,随着转染时间的延长,可以看到不同生长阶段的曲细精管上皮细胞表达GFP,这表明注射和电转后,大鼠的精子发生周期是正常的,并且显微镜下并没有见到明显的组织损伤和出血点。而精子体外存活能力实验也证实(图4-5),与对照组精子相比,处理组精子体外存活能力并没有受到影响。CatSper蛋白家族在精子超活化和受精能力方面具有重要的作用,其中任何一个亚基的异常表达不仅导致精子无法获得超活化,而且失去穿越透明带的能力。在这个研究中,睾丸网微注射结合活体电转成功阻断精子超活化过程,通过对干涉处理后精子体外受精实验证实,精子的受精能力得到了有效抑制。并且睾丸网微注射和活体电转的处理方法并没有对睾丸功能、精子发生周期和精子的体外存活能力等造成明显的影响。这为精子超活化信号通路调控机制研究以及雄性不育原因的揭示,特别是对雄性生殖调控药物的开发具有重要理论意义。