研究背景:卵母细胞发育是为受精及胚胎发育做准备。在这个过程中,卵母细胞获得继续发育能力,并且与周围细胞相互交流,其中与卵丘细胞(CCs)和颗粒细胞的交流对卵母细胞自身发展及卵丘细胞的分化有重要意义。CCs可形成胞质突起穿越透明带,与卵母细胞的质膜建立缝隙连接,形成一个结构和功能完整的合胞体,即为卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs),参与影响卵母细胞发育。在哺乳动物卵母细胞体外培养成熟之前将其周围卵丘细胞去除,会影响卵母细胞的发育,但若同时与COCs或者CCs共培养可恢复裸卵的发育潜能。所以,CCs可支持卵母细胞发育成熟,但具体机制目前仍未阐明。在成年女性卵巢中,大部分卵泡发育结局为发生闭锁,而卵泡闭锁主要由颗粒细胞凋亡起始,氧化应激/活性氧族(ROS)所导致的凋亡机制是其中重要生理和病理机制之一。由于年龄增长、病理条件下内环境的改变而导致的氧化应激损伤都将影响卵泡的发育;在体外培养卵泡时加入抗氧化剂,可阻止卵巢颗粒细胞的氧化应激和凋亡,进而提高卵母细胞发育潜能。本实验室前期工作中构建了小鼠COCs蛋白质谱系,发现抗氧化酶家族Peroxiredoxins家族(Prdxs)是其中的重要组份。Prdxs包括Prdx1-6六种成员。可还原ROS中重要成分H202,具有抗氧化与自由基清除作用,可参与细胞增殖与分化、细胞信号转导等重要功能。我们发现抗氧化酶Prdx4在小鼠成熟COC表达显著高于未成熟COC(p<0.05),于是认为Prdx4在卵泡发育过程中发挥重要作用。Prdx4可分为27kD型和锚定于内质网膜的31kD型。前者缺乏N-末端信号肽可被分泌到细胞外,属于分泌蛋白;后者保留了N-末端信号肽锚定于内质网膜。Prdx4可表达于睾丸组织中,而Prdx4基因敲除的雄性小鼠具有睾丸萎缩,精子减少等表现。但是,关于Prdx4在女性生殖系统中作用及其分子机制,目前国内外还是空白。本课题以COCs体外培养技术为基础,采用基因转染Prdx4超表达或表达沉默的技术,研究Prdx4在卵泡发育过程的作用:通过形态学观察卵泡的发育,以及卵丘细胞氧化应激水平,筛选Prdx4在颗粒细胞凋亡通路中涉及的信号分子,探索prdx4通过抗氧化作用抑制卵丘细胞凋亡,从而促进卵泡发育的分子信号通路。这些研究为探讨卵泡发育障碍相关疾病(如持续性无排卵、多囊卵巢综合症、卵巢功能减退等)病理生理机制增加了理论基础,为诊断和生物学辅助治疗此类疾病提供新的思路,也有助于辅助生殖技术体外受精-胚胎移植(ivf-et)过程中未成熟卵体外培养成熟技术(ivm)技术的改进。材料和方法第一部分:ivf-et患者卵泡液中peroxiredoxin4水平与临床结局的相关性1.通过elisa方法检测ivf-et患者卵泡液中prdx4水平,比较其在妊娠及未妊娠患者中的差异。2.通过非参数sperman相关性分析方法,将prdx4水平与卵母细胞质量相关参数(获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率)进行统计学相关性分析。第二部分:peroxiredoxin4在调控小鼠卵泡发育中的作用1.免疫组化方法检测人卵巢组织中prdx4的表达及细胞定位。2.通过realtimepcr、westernblot方法,比较多囊卵巢综合征患者、围绝经期妇女以及正常育龄妇女卵巢组织中prdx4的表达差异。3.通过realtimepcr、westernblot,比较人成熟优势卵泡、未成熟卵泡颗粒细胞中prdx4的表达。4.免疫组化方法检测不同生长发育期小鼠卵巢组织中prdx4的表达及细胞定位。5.小鼠原代颗粒细胞培养过程加入不同浓度h2o2后继续培养24h,通过realtimepcr、westernblot方法检测prdx4表达改变。6.通过细胞计数、mtt以及edu检测不同浓度h2o2处理后小鼠颗粒细胞增殖改变,westernblot方法检测细胞周期相关蛋白的表达。7.通过流式细胞分析方法,检测不同浓度h2o2处理后小鼠颗粒细胞凋亡改变;realtimepcr方法检测凋亡相关因子的mrna水平。第三部分:peroxiredoxin4促进卵泡发育的机制研究1.体外培养小鼠coc,外源性添加h2o2处理,观察coc形态改变。2.重组腺病毒ad-prdx4和ad-prdx4/sirna感染小鼠coc16-18小时后,realtimepcr验证coc中的prdx4超表达及干涉的效率。3.h2o2处理coc过程中,同时加入重组腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或细胞内ros清除剂tiron处理16-18h后,通过观察卵丘扩展指数以及卵母细胞成熟率评价卵泡发育情况。4.h2o2处理coc过程中,同时加入重组腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或细胞内ros清除剂tiron处理16-18h后,通过tunel检测卵丘细胞以及卵母细胞的凋亡。5.h2o2处理coc过程中,同时加入重组腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或细胞内ros清除剂tiron处理16-18h后,通过realtimepcr方法检测卵丘细胞中内质网通路关键因子,chop10以及grp78mrna表达水平。6.将coc中卵丘细胞以及卵母细胞机械分离,继续培养16-18h,观察卵母细胞成熟率改变。7.h2o2处理coc过程中,同时加入重组腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或细胞内ros清除剂tiron处理16-18h后,检测卵丘细胞以及卵母细胞中camp水平;在裸卵培养过程中加入camp激动剂forskolin,观察卵母细胞成熟率。8.h2o2处理coc过程中,同时加入重组腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或细胞内ros清除剂tiron处理16-18h后,realtimepcr方法检测卵母细胞中自分泌生长因子bmp15及gdf9改变。9.重组腺病毒ad-prdx4/sirna或ad-gfp/sirna感染coc16-18h后,观察卵丘扩展指数以及卵母细胞成熟率。10.ad-prdx4/sirna腺病毒载体感染coc同时加入不同浓度h2o2,观察卵丘扩展指数以及卵母细胞成熟率。第一部分:ivf-et患者卵泡液中peroxiredoxin4水平与临床结局的相关性1.在pcos组和对照组,妊娠妇女卵泡液中prdx4水平均显著高于未妊娠妇女(pcos组:22.0±1.61ng/mlvs.17.09±1.26ng/ml,p<0.05;对照组:22.26±1.65ng/mlvs.16.43±0.97ng/ml,p<0.01)。2.卵泡液中prdx4水平与卵母细胞受精率(r=0.334;p=0.011)及优质胚胎率(r=0.326;p=0.013)均呈显著正相关性。第二部分:peroxiredoxin4在调控小鼠卵泡发育中的作用1.在人卵巢组织中,prdx4蛋白主要表达于卵泡颗粒细胞的细胞质中。2.与对照组相比,pcos患者卵巢组织中prdx4mrna水平和蛋白水平均显著降低,仅为正常育龄妇女的一半(p<0.05),围绝经期妇女卵巢组织中prdx4蛋白表达较育龄期妇女亦显著降低(p<0.05)。3.prdx4在成熟优势卵泡颗粒细胞中表达高于未成熟优势卵泡颗粒细胞,在pcos患者体外培养成熟卵泡颗粒细胞中的表达高于未成熟卵泡颗粒细胞(p<0.05),且与体内成熟卵泡颗粒细胞内表达水平无统计学差异(p>0.05)。4.prdx4蛋白在各发育期小鼠卵巢中均主要表达于颗粒细胞,且prdx4mrna水平及蛋白水平均随小鼠年龄增加而升高,至成熟期达至高峰,表达量约为胎儿期三倍(p<0.01);至老年期降低,与胎儿期表达量相比无统计学差异(p>0.05)。5.小鼠颗粒细胞暴露于较低浓度h2o2(<400μm)时,prdx4表达水平与h2o2浓度具有正相关性;当h2o2浓度为200μm时,prdx4的mrna及蛋白水平表达均至最高峰,约为对照组的4倍;当h2o2浓度继续增加至400μm或者更高,prdx4表达水平迅速降低。6.加入h2o2处理后,小鼠颗粒细胞增殖呈剂量依赖性的降低,h2o2浓度为400μm时已有显著性差异(p<0.05);低浓度h2o2(<400μm)时,cdk1、cdk4、p21以及p15等细胞周期相关蛋白的表达已见升高,而当h2o2浓度升高至400μm或更高浓度,细胞周期蛋白的表达水平降低。7.h2o2处理后,小鼠颗粒细胞凋亡发生剂量依赖性的增加,在400μmh2o2处理时细胞凋亡率为35%,较对照组已有统计学差异(p<0.05);此时caspase3,caspase9,caspase12以及bcl-2等凋亡因子mrna表达水平亦显著升高(p<0.01)。第三部分:peroxiredoxin4促进卵泡发育的机制研究1.小鼠coc体外培养过程中加入h2o2后,卵丘扩展指数及卵母细胞成熟率呈剂量依赖性降低,并且在h2o2为400μm时即有显著性差异(p<0.01)。2.重组腺病毒ad-prdx4感染coc过程中,只能够感染外层卵丘细胞,而不影响卵母细胞内prdx4的表达;重组腺病毒ad-prdx4感染小鼠coc16-18小时后,卵丘细胞内prdx4mrna表达水平升高3倍(p<0.05);同样,重组腺病毒ad-prdx4/sirna只感染卵丘细胞,使prdx4的表达水平降低60%(p<0.05)。3.h2o2处理coc过程中,同时加入重组腺病毒ad-prdx4或细胞内ros清除剂tiron处理16-18h后,均可改善由ros导致的卵丘扩展指数及卵母细胞成熟率下降(p<0.05)。4.在400μmh2o2作用下,coc中卵丘细胞及卵母细胞均发生凋亡;若同时将卵丘细胞中prdx4超表达或加入tiron处理,可改善卵丘细胞及卵母细胞的凋亡。5.h2o2处理coc后,卵丘细胞内质网通路的重要因子chop10及grp78的表达水平显著升高(p<0.05);当加入重组腺病毒ad-prdx4或加入tiron处理,可显著抑制两因子的升高(p<0.05)。6.将卵母细胞与卵丘细胞机械分离后培养,卵母细胞的成熟率无显著改变(p>0.05);同时用h2o2处理,机械分离组和对照组卵母细胞的成熟率均显著降低(p<0.05);当机械分离组同时加入tiron处理或重组腺病毒ad-prdx4,均不会提高卵母细胞成熟率(p>0.05)。7.h2o2处理coc后,卵丘细胞和卵母细胞中camp含量均显著升高(p<0.05);同时加入细胞内ros清除剂tiron或加入重组腺病毒ad-prdx4时,均可显著降低camp水平(p<0.05);裸卵培养过程中,加入h2o2或者camp激动剂forskolin处理均可显著抑制卵母细胞成熟率(p<0.05);同时加入重组腺病毒ad-prdx4后卵母细胞成熟率不发生显著改变(p>0.05)。8.h2o2处理coc后,卵母细胞自分泌生长因子bmp15及gdf9均显著升高(p<0.05);同时加入重组腺病毒Ad-Prdx4或Tiron处理,可降低卵母细胞中两种因子mRNA水平表达。9.重组腺病毒Ad-Prdx4/Si RNA或Ad-GFP/SiRNA感染未成熟COCs 16-18h后,卵丘扩展和卵母细胞成熟率均与对照组无显著差异(p>0.05)。10.COC体外培养过程中,同时加入重组腺病毒Ad-Prdx4/SiRNA及不同浓度H2O2处理,卵丘扩展指数和卵母细胞成熟率发生H2O2剂量依赖性降低;其中400μM H2O2处理时,卵丘扩展指数和卵母细胞成熟率较对照组(无Prdx4干涉组)显著降低(p<0.05)。结论1.IVF-ET患者卵泡液中Prdx4水平与患者卵母细胞受精率及优质胚胎率呈显著正相关性,妊娠妇女卵泡液中Prdx4浓度显著高于未妊娠妇女,提示Prdx4可能参与调节卵母细胞质量,进而影响胚胎质量,导致妊娠结局的差异。2.在人和小鼠卵巢组织中,Prdx4主要定位于颗粒细胞的细胞质内,且与生长发育密切相关,于性成熟期表达量最高,青春期前和老年期表达量均较低。因此,Prdx4与卵巢卵泡发育密切相关。3.Prdx4调节卵泡发育的机制:Prdx4表达于卵泡颗粒细胞中,通过抵御卵泡中氧化应激导致的细胞凋亡发挥调节作用;同时,卵丘细胞Prdx4可通过cAMP经缝隙连接影响卵母细胞发育。4.本研究首次探索了卵巢中Prdx4可通过调节氧化应激状态正向调节卵泡发育的机制,而Prdx4在多囊卵巢综合征以及围绝经期妇女卵巢组织中均呈低表达,可能为该类疾病患者卵泡发育障碍的病理机制之一,可为今后临床进行生物学辅助治疗提供新思路。