背景介绍:　　本研究通过对主流测序平台比较发现，Illumina MiSeq高通量测序技术具有可获得双端各300bp序列、准确率高、测序通量高且测序成本低等优势，因而可用于基于ITS2序列的中药材DNA宏条形码鉴定分析。由此，本研究通过设计不同原料比例混合制得混合草药茶实验组样本，比较分析一代和二代测序用于混合中草药物种鉴定的优劣，拟摸索一种鉴定全面、高效、低成本的混合中草药鉴定方法，为混合中草药的鉴定提供技术参考。　　实验方法:　　本研究统计并收集了99种常见的草药茶原料药材，包括98种植物样本和1种真菌茯苓样本。其中含有220份基原植物样本和217份药材样本，经过DNA提取、PCR扩增获取ITS2序列、PCR产物纯化、测序拼接和ITS2序列注释等标准操作流程，成功获得437条合格的ITS2序列。通过Blast比对和系统发育树构建分析，核实并验证了所有序列的准确性。将本实验获得的99种草药茶基原物种的437条DNA条形码序列与本课题组已有的中药材DNA条形码数据库结合，形成草药茶DNA条形码数据库，为中药材物种鉴定提供准确的数据源。　　选取10种经过基原物种鉴定的常用草药茶药材:桑（Morus alba）、夏枯草（Prunella vulgaris）、荷叶（Nelumbo nucifera）、广金钱草（Desmodium styracifolium）、木蝴蝶（Oroxylum indicum）、岗梅（Ilex asprella）、火炭母（Polygonum chinense）、金银花（Lonicerajaponica）、甘草（Glycyrrhiza uralensis)、布渣叶（Microcos paniculata）。依照不同的药材比例混合，设计5种混合草药茶实验组样品R1-R5，其中R1由夏枯草、广金钱草、岗梅、金银花和布渣叶5种药材等量混合制得;R2由以上十种草药等量混合制得;R3-R5中选取金银花、甘草、布渣叶三种分别以花、根、叶片入药的药材，以5％、2.5％、1％的比例混合，调整岗梅比例补足40％的比例，其余6种草药以固定比例10％等量混合。　　同时用单克隆Sanger测序法和MiSeq高通量测序法对混合草药茶实验组样品R1-R5进行原料物种鉴定。单克隆Sanger测序法是以提取的混合中草药总DNA为模板，利用通用引物ITS2F/ITS3R扩增获取ITS2序列;将PCR回收产物连接到pMD-19T克隆载体、转入感受态大肠杆菌中扩繁并筛选阳性单克隆进行Sanger测序，最终通过序列拼接处理获得原料物种的单克隆ITS2序列。MiSeq高通量测序法通过设计两端加标签的ITS2引物序列，扩增获得的PCR产物进行纯化后，对完整的PCR序列直接构建Miseq PE文库并上机测序，产生PCR产物两端各300bp的序列，借助生物信息学手段进行序列预处理、拼接及物种鉴定等分析。　　研究结果:　　1.Sanger测序结果:可鉴定出部分，存在随机性　　R1随机挑取20个单克隆，R2-R5分别随机挑取100个单克隆进行Sanger测序鉴定。实验结果显示:实验组样品R1分别检测到夏枯草12个、布渣叶5个和金银花1个单克隆序列，未检测到广金钱草和岗梅;R2共检出7个物种，未检测到桑、广金钱草和岗梅;R3共检测出7个物种，未检测到广金钱草、木蝴蝶和岗梅;R4共检测出4个物种，未检测到荷叶、广金钱草、岗梅、火炭母、金银花和甘草6个物种;R5共检测出4个物种，未检测出荷叶、广金钱草、火炭母、金银花、甘草和布渣叶;此外R1-R5中有少数非原料物种检出，如R1检测到醉鱼草状六道木（Zabelia triflora）和紫苏属物种（Perilla）2个非原料物种、R2检测到珍珠梅（Sorbaria sorbifolia）和R5检出2条红花黄钟木（Tabebuia rosea）序列　　总结上述结果发现:单克隆Sanger测序鉴定法对混合药材有一定的鉴定能力，但随机挑取100个克隆并不足以能够检测到所有药材;当原料成分所占比例为2.5％时，布渣叶、甘草、金银花三种药材中仅有布渣叶检出1条ITS2序列;当原料成分所占比例为1％时，三种药材均未检出;20个R1单克隆中未检测到占比为20％的原料物种岗梅，仅在含量增大至37％的100个R5单克隆中检测到4条岗梅序列。这说明单克隆Sanger测序技术对岗梅和含量低于2.5％的原料物种较难检出。　　因此，单克隆Sanger测序技术虽有一定的鉴定能力，但仍无法全面检出混合中草药中的所有原料物种，需要增加单克隆通量对其进行深度检测。　　2.Miseq测序结果:全面检测到所有原料物种　　混合草药茶实验组样品R1-R5各进行3次生物学重复，共计15个测序样本，按照上述的MiSeq高通量测序法流程进行高通量数据分析，共获得原始数据808.5Mb，共计1268299条reads。经质控修饰和过滤拼接后共得到665.2Mb的优质数据，其中包括未拼接序列和已拼接序列两种类型数据。将这两种序列分别与草药茶DNA条形码数据库blast比对鉴定，滤去测序丰度≤0.05％及重复性差的序列后共得到364.9Mb的有效数据，获得659663条ITS2序列，平均每个样本含有43978条ITS2序列。分别对每个混合草药茶实验组样品进行物种鉴定分析，结果如下:　　(1)混合草药茶实验组样品R1的3个平行样本，共得到119811条ITS2序列，其中用于制备实验组样品R1的五种原料物种均被检测到，平均每个文库中检测到21567条夏枯草、384条广金钱草、1047条岗梅、1799条忍冬和15140条布渣叶ITS2序列。　　(2)混合草药茶实验组样品R2的3个平行样本，共得到176982条ITS2序列，用于制备实验组样品的十种原料物种均被检测到，平均每个文库中检测到的ITS2序列有桑3322条、夏枯草15710条、莲266条、广金钱草124条、木蝴蝶10606条、火炭母71条、岗梅402条、忍冬693条、甘草19216条和布渣叶8583条。　　(3)混合草药茶实验组样品R3的3个平行样本，共得到137335条ITS2序列，实验组样品含有的十种原料物种均被检测到，平均每个文库中检测到桑4562条、夏枯草23115条、莲689条、广金钱草372条、木蝴蝶1498条、火炭母174条、岗梅1465条、忍冬1390条、甘草8642条和布渣叶3872条。　　(4)混合草药茶实验组样品R4的3个平行样本，共得到105881条ITS2序列，实验组样品中的十种原料物种均被检测到，平均每个文库中检测到桑2393条、夏枯草10286条、莲232条、广金钱草78条、木蝴蝶17745条、火炭母32条、岗梅380条、忍冬191条、甘草1323条和布渣叶1241条。　　(5)混合草药茶实验组样品R5的3个平行样本，共得到101703条ITS2序列，用于制备实验组样品的十种原料物种均被检测到，平均每个文库中检测到桑4729条、夏枯草12623条、莲383条、广金钱草223条、木蝴蝶17797条、火炭母55条、岗梅2590条、忍冬95条、甘草1850条和布渣叶934条。　　该结果充分说明Miseq高通量测序技术可以准确且全面鉴定出由不同药用部位组成的十味混合草药茶生物组分，且每份样本仅需要53.9Mb测序量。此外，本研究中也发现高通量测序鉴定法同样会检出一些非目标物种。例如:在R1和R4样品中同时检测到木香花(Rosa banksiae)，最多含有39条，但并不是3个平行样本同时检测到，故可过滤掉，不作考察。　　讨论与结论:　　以相同的5种混合草药茶实验组样品为研究对象，单克隆Sanger测序法共随机挑取420余个单克隆进行测序，最终获得合格的ITS2序列389条，最多可以检测十种原料物种中的7种;MiSeq高通量测序法采用3次生物学重复实验，共计15份样本，共获得808.5Mb原始数据，平均每个文库有53.9Mb数据量，每份样本中所含有的原料物种均被检测到，含量仅有1％的忍冬、甘草和布渣叶也均被检测到。然而，试验中也发现，一代和二代的ITS2测序鉴定中均会检出一些紫苏属和木香花等非目标物种，但依据Miseq高通量实验中的三次生物学平行重复，可将实验过程中气溶胶、建库污染和测序污染等引入的非目标物种过滤掉。　　综上所述，MiSeq高通量测序法与单克隆Sanger测序法测序法相比，具有物种鉴定高效、全面、且成本低等优点。因此，本研究通过建立草药茶DNA条形码数据库以及基于ITS2序列的一代和二代DNA测序技术对混合药材物种鉴定的方法比较分析，初步建立了一种基于Miseq高通量技术鉴定混合中草药物种的DNA宏条形码鉴定方法，并提供了其详细的具体操作流程，以实现准确、高效、全面且成本低廉的物种鉴定，可作为混合药材物种鉴定的有效补充方法，为解决混合药材鉴定难的问题提供强有力的技术参考。