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目的:采用整合药理学方法揭示木香油方治疗脑卒中的化学成分及作用靶点;探讨木香油方挥发油抗氧糖剥夺致PC12细胞损伤的作用及机制。方法:1.借助整合药理学平台,收集木香、胡椒、细辛的化学成分和脑卒中的相关靶点,构建蛋白质-蛋白质相互作用信息网络,再通过GO基因功能和KEGG通路分析木香油方挥发油治疗脑卒中的相关靶点及通路。2.(1)将PC12细胞分为对照组,木香油方挥发油组(终浓度分别为32,16,8,4,2,1μg/mL)。采用CCK-8试剂盒检测木香油方挥发油对PC12细胞毒性的影响。(2)建立PC12细胞氧糖剥夺2h再灌注24h损伤模型,分为对照组,氧糖剥夺再灌注组,阳性药尼莫地平组(5μg/ml),氧糖剥夺再灌注+木香油方挥发油(1,2,4μg/ml)组。采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH漏出率、化学荧光染色法检测钙离子浓度变化、流式细胞术检测线粒体膜电位变化。3.(1)将PC12细胞分为对照组,氧糖剥夺再灌注组,氧糖剥夺再灌注+木香油方挥发油(4μg/ml)组,氧糖剥夺再灌注+自噬抑制剂3-MA(10μM)组,氧糖剥夺再灌注+3-MA+木香油方挥发油(4μg/ml)组,采用免疫荧光法和免疫印迹技术检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的表达,MDC染色法检测PC12细胞各组自噬活性情况。(2)将PC12细胞分为对照组,氧糖剥夺再灌注组,氧糖剥夺再灌注+木香油方挥发油(4μg/ml)组,氧糖剥夺再灌注+AMPK抑制剂化合物C(2μM)组,氧糖剥夺再灌注+化合物C+木香油方挥发油(4μg/ml)组,免疫印迹技术检测AMPK、p-AMPKThr172、p-mTORSer2448、ULK1、p70S6K、p-p70S6KThr389、Beclin1和p62蛋白的表达。结果:1.基于整合药理学的木香油方治疗脑卒中的机制检索到木香、胡椒、细辛中共189个化学成分,其药理作用涉及99个核心靶标,与脑卒中直接相关的靶点有离子型谷氨酸受体,即NMDA受体(GRIN2A,GRIN2B,GRIN2C,GRIN2D,GRIN1)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、兴奋性氨基酸转运体(SLC1A2),雄激素受体(AR),孕酮受体(PGR),γ-分泌酶亚基(PSENEN),过氧化氢酶(CAT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等。GO基因功能和KEGG通路富集分析显示这些关键靶标可能涉及神经退行性疾病、雌激素信号通路、神经营养因子信号通路、GnRH信号通路、细胞生长和死亡、神经系统、甲状腺激素信号传导通路、内分泌系统等过程。2.木香油方挥发油对氧糖剥夺再灌注(OGD/R)致PC12细胞损伤的保护作用(1)木香油方挥发油对PC12细胞毒性的结果显示:不同浓度木香油方挥发油分别作用PC12细胞,随着木香油方挥发油浓度的增加,其抑制PC12细胞存活的作用增强。木香油方挥发油的剂量为4,2,1μg/mL时对PC12细胞毒性相对较小,因此我们选择木香油方挥发油的剂量为4,2,1μg/mL。(2)木香油方挥发油对PC12细胞活力的影响:与对照组相比,OGD/R组细胞存活率显著降低;与OGD/R组相比,木香油方挥发油(1,2,4μg/ml)组和尼莫地平组中细胞存活率升高(p<0.01),且木香油方挥发油(4μg/ml)的效果与尼莫地平组相当。(3)木香油方挥发油对PC12细胞LDH漏出率的影响:与对照组相比,OGD/R组LDH漏出率显著升高;与OGD/R组相比,木香油方挥发油(1,2,4μg/ml)组和尼莫地平组中LDH漏出率降低(p<0.01),且木香油方挥发油(4μg/ml)的效果与尼莫地平组相当。(4)木香油方挥发油对PC12细胞线粒体膜电位变化:与对照组相比,OGD/R组细胞线粒体膜电位明显下降;与OGD/R组相比,木香油方挥发油(1,2,4μg/ml)组和尼莫地平组减少了线粒体膜电位的下降(p<0.01),且木香油方挥发油(4μg/ml)作用与尼莫地平组相当。(5)木香油方挥发油对PC12细胞Ca2+浓度的影响:与对照组相比,OGD/R组绿色荧光增强;与OGD/R组相比,木香油方挥发油(1,2,4μg/ml)组绿色荧光减弱(p<0.01),且木香油方挥发油(4μg/ml)作用与尼莫地平组相当。3.木香油方挥发油对氧糖剥夺再灌注致PC12细胞损伤后保护机制的研究(1)MDC染色结果显示:与对照组相比,OGD/R组绿色荧光增强;与OGD/R组相比,木香油方挥发油和3-MA组能够降低绿色荧光强度;与木香油方挥发油组相比,木香油方挥发油和3-MA合用能够显著降低绿色荧光强度(p<0.05)。(2)免疫荧光结果显示:与对照组相比,OGD/R组中LC3、Beclin1蛋白表达上调,p62蛋白表达下调;与OGD/R组相比,木香油方挥发油和3-MA组能够下调LC3、Beclin1的表达,上调p62蛋白的表达;与木香油方挥发油组相比,木香油方挥发油和3-MA合用能够显著下调LC3、Beclin1的表达,上调p62蛋白的表达(p<0.05)。(3)免疫印迹结果显示:与对照组相比,OGD/R组中LC3、Beclin1蛋白表达上调,p62蛋白表达下调;与OGD/R组相比,木香油方挥发油和3-MA组能够下调LC3、Beclin1的表达,上调p62蛋白的表达;与木香油方挥发油组相比,木香油方挥发油和3-MA合用能够显著下调LC3、Beclin1的表达,上调p62蛋白的表达(p<0.05)。(4)免疫印迹结果显示:与对照组相比,OGD/R组中p-AMPKThr172、ULK1、Beclin1蛋白表达上调,p-mTORSer2448、p-p70S6KThr389和p62蛋白表达下调;与OGD/R组相比,木香油方挥发油组和化合物C组下调了p-AMPKThr172、ULK1、Beclin1蛋白表达,上调了p-mTORSer2448、p-p70S6KThr389和p62蛋白表达;与木香油方挥发油组相比,木香油方挥发油和化合物C合用显著下调了p-AMPKThr172、ULK1、Beclin1蛋白表达,上调了p-mTORSer2448、p-p70S6KThr389和p62蛋白表达(p<0.05)。结论:1.借助整合药理学平台揭示了木香油方治疗脑卒中的化学成分、关键靶标AMPK及参与的过程涉及到神经退行性疾病、雌激素信号通路、神经营养因子信号通路、GnRH信号通路、细胞生长和死亡、神经系统、甲状腺激素信号传导通路、内分泌系统等过程,为研究木香油方治疗脑卒中的作用机制提供科学依据。2.木香油方挥发油对氧糖剥夺再灌注致PC12细胞损伤具有保护作用,其机制与抑制AMPK/mTOR信号通路介导的自噬有关。