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固定化酶作为材料、生物、化学等多个学科的交叉研究点之一,受到众多研究者的关注。而随着固定化酶研究的不断深入,酶的固定化正经历从载体的选择到载体的设计的演变。固定化酶的微环境是否适宜直接决定固定化酶的活性、稳定性和选择性,而载体孔径、亲/疏水性、Zeta电位、比表面积和p H值等微环境单一因素对固定化酶活性的影响国内外文献报道较多,但关注微环境多参数对酶活性协同效应报道较少。因此,对固定化酶微环境多参数协同优化效应与固定化酶活性的研究,对固定化酶工业应用具有一定学术研究价值及潜在应用价值,为固定化酶载体的设计提供依据。因此,本文基于相关分析的统计方法,以7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）为模型酶,重点考察载体孔径、亲/疏水性、表面电荷、比表面积四种参数与酶活性的关系,并构建这四种固定化酶微环境参数与酶活性的多重回归模型,探究这四种固定化酶微环境对固定化酶活性的协同影响作用,为固定化酶载体的设计提供理论依据。在此基础之上,以环氧基树脂为基质材料,设计一系列固定化酶载体,并用其最佳固定化酶载体共固定化7α-HSDH和7β-HSDH用于复杂基质鸡胆粉溶液的原位生物转化,从而拓展了基于微环境多参数所设计固定化酶载体的应用。本文的主要内容及结论如下:（1）基于相关分析的统计方法,研究了固定化酶微环境与酶活性的关系,并建立了固定化酶微环境与酶活性的多重回归模型。以21种不同树脂,表征了固定化酶载体的Zeta电位、亲/疏水性、孔径以及比表面积4种微环境参数。以7α-HSDH和7β-HSDH为模型酶,分别将其固定于树脂上。1)将固定化7α-HSDH和7β-HSDH的比活与载体的微环境参数进行了相关分析,据相关系数绝对值的大小评价相关程度。结果表明,对固定化7α-HSDH和7β-HSDH活性影响最为显著的是载体的孔径（相关系数分别为-0.8202,-0.8603）,其次为载体的Zeta电位（相关系数分别为0.5992,0.5563）。中等疏水性（水接触角为50°）载体能给固定化7α-HSDH和7β-HSDH提供适宜的微环境,使其表现为最高活性。2)建立了固定化7α-HSDH和7β-HSDH的比活与四种微环境参数的多重回归模型。其模型分别为:y1=0.008448 x1+0.0003340 x2-0.008708 x3+0.000227 x4+0.3306;y2=0.012100x1+0.0005980x2-0.01655 x3-0.00002700x4+0.6645,其中y1,y2分别为固定化7α-HSDH和7β-HSDH的比活,x1为载体的Zeta电位,x2为水接触角,x3为载体孔径,x4为载体比表面积。通过四种微环境参数预测酶活性,其外部验证复相关系数R2分别为0.7154和0.7532,该两个模型取得了较好的预测效果,能反应固定化酶微环境多个参数对固定化酶活性的协同影响作用,并为固定化酶载体的设计提供可靠依据。（2）基于上述相关分析及多重回归模型结论,以不同质量浓度的壳聚糖修饰环氧基树脂能有效调变其孔径以及电荷为基础,设计了一系列疏水性中等,具有不同孔径（即拥挤程度）及电荷的载体材料,采用多重回归模型预测各固定化酶的活性,并考察了固定化酶微环境拥挤程度及电荷对固定化酶其它性能的影响。结果表明:1)经多重回归模型预测的固定化酶活性值与实验值一致。2)随着材料的孔径的减小,即固定化酶微环境拥挤程度的增加,加之酶活性中心与材料表面电荷的斥力作用,使得固定化酶的活力得到有效增强。固定化酶活力的增强进而使得固定化双酶的催化效率有效提高。3)改变固定化酶微环境的拥挤程度同样能增强固定化酶的热稳定性和重复使用性。在经过7次重复使用后,具有高拥挤程度的EP-0.5-C固定双酶后,其催化效率下降幅度很小（TCDCA的转化率从85.45±0.36%下降到84.32±0.55%,TUDCA的收率从55.02±2.07%下降到51.54±0.67%）。所得结果与上述相关分析及模型结论一致,孔径和电荷对酶活性影响显著。另外,在固定化酶周围拥挤的微环境及材料的表面电荷对固定化酶的热稳定性、重复使用性及催化效率也能产生显著的影响。（3）载体微环境的改变不仅能改变固定化酶的性能,也能改变固定化酶载体的性能。进一步探究了上述表现最佳性能的EP-0.5-C载体对底物TCDCA和TUDCA的吸附行为,并与环氧基树脂的吸附行为进行了比较。EP-0.5-C对TUDCA和TCDCA的吸附量均小于环氧基树脂对TUDCA和TCDCA的吸附量。比较EP-0.5-C与壳聚糖微球的机械性能发现,EP-0.5-C比壳聚糖微球具有更优越的机械性能。利用壳聚糖改性环氧基树脂以改变固定化酶载体的微环境的策略,能改善载体的性能。（4）应用7α-,7β-HSDH共固定化在EP-0.5-C上对复杂底物鸡胆粉溶液的原位生物转化。系统的优化了其反应条件,并通过对EP-0.5-C上共固定化7α-,7β-HSDH重复使用性的研究表明,在经过9次重复使用后,鸡胆粉中TCDCA的转化率仍保持69.82±2.1%,TUDCA的收率仍保持46.77±2%。而本课题组前期采用壳聚糖微球为载体固定化7α-,7β-HSDH,连续4次转化后,TCDCA的转化率低于40%,TUDCA的收率低于20%,说明EP-0.5-C上共固定化7α-,7β-HSDH的重复使用性得到显著提高。通过对产物成分进行分析表明,在大部分胆汁酸成分TCDCA转化为TUDCA的同时,保留了非胆汁酸成分,达到了原位生物转化的目的且反应产物的主要成分与天然熊胆粉相似,从而拓展了基于微环境多参数所设计固定化酶载体的应用。