目前,手性药物的市值越来越高从而使得其中间体的生产越来越受到关注。在有机合成中,具有光学活性的氨基酸被广泛的用作辅基、手性原料和诱导不对称反应的诱导剂,具有光学活性的氨基酸也是构成蛋白质、多肽和其他许多重要的天然产物如农药化学品和医药分子的功能模块。L-叔亮氨酸(L-Tle)作为一种非常重要的氨基酸,被广泛的用作不对称合成中活性化合物的基本模块。同时,L-Tle也是制备抗艾滋病药物或抗肿瘤药物的重要中间体。因此,农业和制药行业对于高效合成农业用化学品和基础中间体如手性药物中间体的需求较大。本论文主要围绕筛选和挖掘海洋来源的氧化还原酶制备新型的生物催化剂、构建LeuDH与FDH的偶联系统,利用合成生物学技术调控与协调生物法制备L-Tle相关的关键酶、改善和提高关键酶的活性和催化性能、优化催化体系等方面进行了一些探究,旨在从本质和方法上改善和优化该系统,以期进一步提高L-Tle酶法制备的效率。论文的主要工作包括以下四个部分:第一,通过PCR扩增获得了一种独特的来源于海洋菌株Alcanivorax dieselolei的LeuDH基因,其编码的氨基酸序列与已报道的序列的相似性较低,其中相似性最高的是来源于Thermoactinomyces intermedius的LeuDH,相似性为42.6%。酶学性质的分析结果表明,该酶的最适温度和pH分别是30 ℃和6.5,同时其表现出嗜冷的活性,在0-37 ℃的条件下,它的活性能保持90%以上。该LeuDH在弱碱的环境中(pH 6.0-8.5)的稳定性比来源于Thermoactinomyces intermedius的稳定性高。在最适底物浓度条件下,该LeuDH催化底物三甲基丙酮酸转化为L-Tle的手性选择性e.e.值大于99%。第二,通过串联LeuDH与FDH基因表达、利用基于合成生物学调控元件中的不同强度的RBS调控基因的表达水平,并检测系统制备目标产物的能力,构建和评估了可以协调多酶协同表达的系统并将其应用到手性药物中间体L-Tle的合成中。研究结果表明该可协调多酶协同表达的系统具有较高的手性选择性(e.e.>99%)、低成本、高稳定性、接近100%转化率的优势。本实验提供了一种研究功能基因代谢机理和构建全细胞催化系统制备手性羟基酸或手性氨基酸的方法。第三,通过将不同来源的甲酸脱氢酶进行三维结构对比等方法,预测和识别了来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶(CboFDH)的活性位点、底物和辅酶结合位点,67P、98P、99F、93V、94G、119N、123V、256D、257A、260A、283V、287Q、311H、313S、314G和321T。为了提高CboFDH的酶学性质,位于活性中心、底物和辅酶结合位点附近的氨基酸残基被选择进行突变。实验结果表明,V120S对底物甲酸铵的催化效率(kat/Km)最高,其催化速率(kcat)和催化效率分别是野生型的3.48和1.60倍。叠加突变子(V120S-N187D)对辅酶的催化效率最高,为野生型的1.50倍。同时,单点突变子和叠加突变子表现出比野生型较高的稳定性。最后,通过三维结构建模和位点分析解析了单点突变子和叠加突变子性质改变的结构和功能的关系。第四,本实验构建了一种酶法制备L-Tle条件优化的方法,通过使用均匀设计和回归分析建立了目标产物L-Tle的产量与其发酵条件之间的关系的数学关系式。之后对所获得数学方程进行验证和指导L-Tle的合成,体系制备L-Tle的时空产率和手性选择性(e.e.值)分别是505.92 g L-1d-1和99%。