目的:激素在胚胎植入过程及妊娠的维持中均起着重要的调控作用。以往对妊娠中激素的研究多集中于雌激素和孕激素与子宫内膜功能的关系,关于胰岛素是否参与了妊娠早期子宫内膜容受性及蜕膜化建立的研究报道甚少。现有研究发现子宫内膜上存在胰岛素受体。临床高胰岛素血症的育龄妇女(如肥胖患者),大多数伴有不孕和早期流产。因此,本研究拟从子宫内膜容受性和子宫内膜蜕膜化两个角度,探讨高胰岛素对早孕小鼠子宫内膜功能的影响,以了解胰岛素对妊娠过程的调节,为临床高胰岛素血症导致的不孕症、自然流产的诊断与治疗寻求新的手段。方法:1、建立高胰岛素小鼠模型:实验组采用长效胰岛素长时间梯度剂量皮下注射,对照组用同等剂量生理盐水皮下注射的方法构建动物模型。监测小鼠血糖及体重。23天后,采用Elisa方法对小鼠血清胰岛素水平进行检测,判断高胰岛素小鼠模型是否建立成功。2、建立小鼠妊娠模型:高胰岛素小鼠模型建立成功后,将胰岛素处理组和对照组的雌性小鼠与正常雄性小鼠交配,晚上8点左右合笼(雌性:雄性,2:1),次日早上8点左右检查阴栓。看到阴栓的为妊娠第1天(d1),苦味酸标记受孕小鼠。收集d4、d5、d6、d7和d8天孕鼠子宫内膜组织。人工诱导蜕膜化模型:将胰岛素处理组和对照组的雌性小鼠与输精管结扎的雄性小鼠合笼交配,次日看到阴栓的为假孕第1天(pd1)。小鼠假孕4天(pd4)一侧宫角注射玉米油100μl诱导蜕膜化,对侧宫角不注射作为对照,于pd8处死,收集子宫组织。3、高胰岛素对早孕小鼠子宫内膜功能的影响:elisa方法检测小鼠血清胰岛素、孕酮和雌二醇水平;解剖观察子宫大体形态;he染色法观察子宫的微细结构;实时定量荧光pcr,蛋白质印迹法和免疫组织化学检测d4和d5天小鼠子宫内膜容受性相关标记物esr1、esr2、pgr和hoxa10的表达及d6、d7和d8天小鼠子宫内膜蜕膜化相关标记物pgr、esr2、bmp2和prl的表达。westernblot对mtor信号通路子宫内膜容受性相关分子的表达进行分析。最后,计数并比较胰岛素处理组与对照组孕鼠的妊娠天数及每窝幼崽数。结果:1、高胰岛素小鼠模型的构建及血清激素分析:胰岛素处理组小鼠血糖及血清胰岛素水平显著高于对照组,模型构建成功。此外,胰岛素处理组小鼠血糖和homa值显著高于对照组,提示胰岛素处理组小鼠出现胰岛素抵抗。血清激素检测结果显示,胰岛素处理组血清e2显著低于正常对照组(p<0.05),p4显著高于对照组(p<0.05)。2、高胰岛素影响妊娠早期小鼠的子宫内膜容受性:胰岛素处理组与对照组比较,d4和d5天子宫的大体形态及微细结构没有显著差异,且d5天的胚胎着床点数量也没有显著改变(p>0.05)。但是进一步检测发现,d4天胰岛素处理组孕鼠子宫内膜组织的esr1、pgr和hoxa10mrna表达较对照组显著增高(p<0.05),而esr2mrna表达下降。d5天胰岛素处理组esr2和hoxa10mrna表达较对照组显著增高(p<0.05),esr1mrna表达较对照组显著降低(p<0.05),westernblot检测到其蛋白表达量与基因表达一致。免疫组织化学结果显示:d4天对照组esr1、esr2、pgr和hoxa10在子宫上皮细胞和基质细胞的细胞核均显现为棕黄色,表达均为阳性,胰岛素处理组esr1、pgr和hoxa10为棕黑色,表达为强阳性,而esr2显现棕黄色,表达为阳性。d5天对照组esr2、pgr和hoxa10在子宫上皮细胞和基质细胞的细胞核均显现为棕黄色,表达均为阳性,胰岛素处理组esr2、pgr和hoxa10为棕黑色,表达为强阳性,而esr1显现棕黄色,表达为阳性。3、高胰岛素抑制孕鼠子宫内膜蜕膜化:d6天胰岛素处理组子宫形态与对照组比较无显著差别,d7和d8天胰岛素处理组子宫部分胚胎着床点形态与对照组相比体积变小。d6、d7和d8天胚胎着床点数量显著减少(p<0.05),且微细结构可见部分胚层发育不全。人工诱导蜕膜化模型小鼠子宫形态不规则,可见胞质空泡化的蜕膜细胞。在d6、d7和d8天人工诱导蜕膜化模型中,胰岛素处理组孕鼠子宫蜕膜组织的prl、bmp2、pgr和esr2mrna表达均较对照组显著降低(p<0.05);westernblot检测到prl、bmp2、pgr和esr2蛋白表达量也均较对照组显著降低(p<0.05)。pgr和esr2表达免疫组织化学结果显示:在d6、d7和d8天,对照组子宫上皮细胞和基质细胞的细胞核均显现为棕黄色,表达为阳性,而在胰岛素处理组显示浅黄色,表达为弱阳性。在d6和d7天,bmp2在d6和d7天对照组子宫上皮细胞和基质细胞的细胞核均显现为棕黄色,表达为阳性,d8天显现为棕黑色,表达为强阳性,但在d6、d7和d8天胰岛素处理组均显现为淡黄色,表达为弱阳性。prl在d6、d7和d8天对照组子宫上皮细胞和基质细胞的细胞核均显现为棕黑色,表达为强阳性。而胰岛素处理组均显现为淡黄色,表达为弱阳性。4、高胰岛素影响妊娠早期子宫内膜mtor通路:对d4、d5和d6天孕鼠子宫内膜mtor信号通路的相关蛋白mtor、p-mtor、p70s6k和p-p70s6k的检测发现,胰岛素处理组的p-mtor和p-p70s6k蛋白表达均较对照组显著增高(p<0.05)。5、高胰岛素导致小鼠妊娠延长和产仔数减少:胰岛素处理组的小鼠平均妊娠天数(21±0.71天)显著高于对照组(18±0.50天)(p<0.05);胰岛素处理组的小鼠平均每窝生的幼崽数量(10±0.50只)显著低于对照组(13±1.12只)(p<0.05)。结论:1、胰岛素处理组小鼠血糖和homa值显著高于对照组,提示在高胰岛素的作用下,小鼠出现胰岛素抵抗。e2显著低于对照组,p4显著高于对照组,提示高胰岛素导致孕鼠体内激素紊乱。2、胚胎植入早期可以划分为两个关键的时期:第一期,子宫处于容受胚泡的状态以使胚泡获得着床的能力,此期也被称为植入“窗口期”;第二期,胚泡完全被包埋入子宫内膜,子宫内膜蜕膜化反应。在植入“窗口期”,胰岛素处理组孕鼠胚胎个数和子宫内膜的微细结构与对照组没有显著变化,但是子宫内膜容受性相关基因及蛋白Esr1、Esr2、Pgr和Hoxa10表达异常,提示尽管在高胰岛素的作用下胚胎可以着床,但早孕小鼠子宫内膜容受性轻微受损。3、在子宫内膜蜕膜化期,胰岛素处理组孕鼠胚胎个数显著减少,且部分孕鼠胚胎着床点的大体形态异常,且子宫内膜蜕膜化的相关基因及蛋白Prl、Bmp2、Pgr和Esr2均表达异常。说明高胰岛素能够影响子宫内膜蜕膜化。4、孕鼠血液中胰岛素水平增高会导致延长妊娠,并且导致产仔率下降。5、胰岛素处理组的孕鼠子宫内膜p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达显著增强,提示mTOR信号通路可能参与了高胰岛素引起的孕鼠子宫内膜容受性受损这一过程,具体机制有待进一步研究。