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背景和目的 Mints基因最早是作为弗里德赖西运动失调(Friedreich ataxia,FRDA)而被克隆的，命名为X11。在研究可以与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein,APP)结合的蛋白质时，发现X11分子可以通过其PTB结构域与APP结合，从而延长APP在细胞内的半衰期，并减少具有神经毒性且参与AD老年斑形成的β-淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)的分泌。这一发现为AD的预防和治疗提供了重要线索。随后在运用酵母双杂交技术研究可以与突触囊泡胞吐中发挥关键作用的膜转运蛋白Munc18-1结合的分子时，发现并且鉴定了两个可以与之结合的蛋白质，命名为Mint(Munc18.1 interactingprotein,Mintl,Mint2)。经过序列分析，显示Mint1和Mint2的部分序列是曾经被认为是FRDA的X11基因的表达产物X11蛋白。Masaya Okamoto证实人与鼠的X11蛋白是异构体，而且Mints蛋白在进化中是保守的。 到目前为止我们已知Mints家族有三个成员，Mint1、Mint2和Mint3。其中Mint1和Mint2分子的分布具有神经元特异性，而Mint3分布较为广泛。Mints分子有着保守的羧基端和各异的氨基端。在羧基端有一个PTB结构域和两个PDZ结构域，同时Mints分子也是目前已知惟一既含有PTB结构域又含有PDZ结构域的蛋白质，通过其PTB和PDZ结构域可以广泛地参与神经元内信号转导、囊泡转运与递质释放、受体靶向定位等，并且可与APP结合调节其代谢，与其他含有PDZ结构域的分子结合形成网络广泛参与细胞的代谢等。通过对Mint分子的研究，我们对阿尔茨海默病的认识不断深入，这将有可能对该病的治疗提供新郑州大学2004年硕士研究生毕业论文M，ntZ分子在正常大鼠脊髓中表达与分布的研究思路。同时，对Mints分子的研究也能够为神经元间经突触的信息传递机制进行新的补充。故此Yatsuka等通过原位杂交技术和免疫组化技术对Mintl与MintZ分子在脑内的分布进行了详尽的形态学研究，对其在大鼠脑内的分布予以描述。在此基础上为了解Minis分子在突触囊泡胞吐过程中的作用，Yatsuka等通过电子显微镜对分布于海马神经元突触进行研究，阐述了Mintl分子在突触前膜和突触后膜的分布情况，Angela等通过western blot证实MintZ而不是Mintl分子在脊髓中有较高的表达。 为进一步阐明Mints分子在中枢神经系统的表达和分布情况，本实验采用原位杂交的厂方法，首次检侧了MintZ mRNA在大鼠脊髓中的表达一与分布。通过W。似，n川。t、荧光免疫组化法结合激光共聚焦显微镜‘c()11角cal)技术一首次阐述 r Min佗分子在脊髓中的分布与表达。实验发现Mi，lt2分子及其mRNA广泛分介:一f脊髓各节段神经元内，在神经元内MintZ分子在核周质和突起内均有表达少其中以前角运动神经元和后角边缘核内Min仅分子表达量较高。以卜这些研究元善了M山，2分子在中枢的分布，也为Mints分子在脊髓中的功能研究奠定形态学基础。方法1.构建表达质粒:通过分子克隆方法将MintZ分子411一656位碱基克隆入表达 载体pGEX4T3中，经酶切和测序鉴定。2.蛋白的表达与纯化:将构建好的质粒转化大肠杆菌BLZI，破菌提取诱导前与 诱导后总蛋白经SDS一PAGE电泳确认蛋白表达后，过柱纯化。3.MintZ自制抗体特异性检侧:通过Westem blot与商业抗体进行比较抗体的特 异性。4.用Westem blot检测MintZ分子在脊髓中的表达:正常大鼠脑和脊髓裂解处 理后，经10%SDS一聚丙烯酸胺电泳分离，再经电转膜后，加入抗体显色。5.构建转录模板质粒:利用DNAstar来设计探针序列，并在Genebank中进行 比较后确定体外转录序列，设计引物，通过PCR方法将体外转录探针序列扩 增，通过BamHI和EcoRI双酶切连入载体中。送测序鉴定。6.MintZ cRNA探针的体外转录:用BamHI将测序后的质粒模板线性化，在 r3转录酶作用下合成地高辛标记的cRNA探针。郑州大学2004年硕士研究生毕业论文MilltZ分子在正常大鼠脊髓中表达与分布的研究7.通过原位杂交来检测MintZ mRNA在脊髓各节段的表达:正常大鼠经灌注取 材后，冰冻切片，采用漂浮法进行原位杂交显色。8.免疫荧光组织化学染色:取大鼠脊髓，冰冻切片，采用贴片两步法显色。封 片后，用激光共聚焦显微镜(confocal)扫描切片并记录结果。结果1.SDS一队GE结果显示大肠杆菌BLZI经诱导后表达37kD的GST一MintZ融 合蛋白，与设计的蛋白大小一致。2.Westem blot结果显示自制抗体的特异性与商业抗体是一致的，并经免疫组化 吸收实验和空白对照实验证实其特异性。3.Westem blot结果显示在大鼠脑和脊髓中均有MintZ分子表达，而在阴性对照 肾脏中MintZ分子不表达。4.原位杂交结果:在脊髓颈段、胸段和腰段均可见到MintZ mRNA广一泛的分布 于脊髓灰质神经元中，在白质内无特异性染色;脊髓灰质各板层的神经元均表 达MintZ mRNA，其中前角运动神经元和后角边缘核中表达量较高，前角运 动神经元的外侧群表达更为明显;在神经元内MiniZ mRNA主要分布于核周 质和突起中，细胞核内未见有MintZ mRNA表达。同时通过与阴性组织大鼠 肝脏进行原位杂交?