论文部分内容阅读
目的:结直肠癌colorectal cancer(CRC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。CRC发病常隐匿,且易出现早期转移,其预后与疾病分期关系密切。因此,如何早期诊断及提高CRC患者生存率是目前研究的热点。信号传导和转录激活因子(signal transduction and activator of transcription,STAT)蛋白,存在于细胞浆内蛋白,经酪氨酸磷酸化激活后形成二聚体,入核后结合在靶基因启动子区域,调控基因表达。STAT既是细胞信号转导蛋白,也是核转录因子,可调控多种基因转录,包括与肿瘤增殖、迁移有关的基因。Janus激酶(Janus kinase,JAK)-STAT信号通路可参与免疫功能,及细胞增殖和分化过程。持续活化的JAK-STAT信号通路与肿瘤的发生发展有关,可调控肿瘤的恶性转化过程。目前研究发现,JAK-STAT信号通路在血液系统恶性肿瘤及实体瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌及CRC的发生发展中发挥作用。在CRC中,JAK-STAT信号通路的调控机制仍需进一步探讨。JAK-STAT信号通路可调控50多种细胞因子转录。研究发现细胞因子可影响肿瘤细胞免疫微环境,导致肿瘤增殖、迁移,目前研究人员主要探讨JAK-STAT信号通路与细胞因子的相互作用和关系,JAK-STAT信号通路可能作为肿瘤的治疗靶点,提高患者生存质量。有研究发现肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)、白介素-6(interleukins-6,IL-6)和干扰素γ(interferons,IFN-γ)可使STAT表达上调。IFNs和IL-6作用于细胞,促使JAK1和JAK2与受体亚基γ链(γc)和IL6ST结合,介导细胞信号转导,促进STATs表达。有研究表明,IL6ST与胃癌、肝细胞癌、骨肉瘤、乳腺癌发病密切相关,可能作为部分实体瘤的生物标记物;CXCL9在胃癌、乳腺癌、肝细胞癌、子宫颈腺癌的发生发展中具有重要作用。本研究采用RT2Profiler PCR Array的方法,评估CRC中JAK-STAT信号通路蛋白及通路相关细胞因子基因表达情况,筛选差异表达的基因,以期寻找CRC新的生物标志物,为进一步探究JAK-STAT信号通路在CRC发生发展中的调控机制。研究方法:收集CRC患者的肿瘤和正常新鲜组织标本,进行RT2Profiler PCR Array实验分析JAK-STAT信号通路中84个目的基因(GOI),得到14个差异基因。通过GO分析,KEGG分析及TCGA数据库对筛选出的差异基因进行生物信息学分析。利用CRC患者组织,通过实时荧光定量PCR(Realtime-PCR,RT-PCR)法检测筛选出5个差异基因:CXCL9、IL6ST、A2M、GHR、FAS。通过Western blot检测了IL6ST和CXCL9在CRC和正常结肠组织中的表达,然后收集组织切片,进行H&E染色和免疫组化检测,评估了患者的病理学特征和临床特征。根据患者随访信息绘制IL6ST和CXCL9单因素生存分析曲线。构建IL6ST过表达的CRC细胞系,使用Western blot检测STAT3和p-STAT3的表达水平,同时检测其对细胞周期、增殖、迁移、侵袭、粘附率及凋亡的影响。结果:1、本研究利用RT2Profiler PCR Array,检测3对CRC患者组织中JAK-STAT信号通路蛋白变化情况,筛选出14个差异基因,其中CXCL9表达上调;GHR、FCER2、NR3C1、IL6ST、A2M、FAS、PIAS2、SMAD2、PTPRC、STAT4、INSR、SMAD4和B2M表达均下调。2、本研究通过GO分析,KEGG分析及TCGA数据库对筛选出的14个差异基因进行生物信息学分析,结果显示CXCL9、IL6ST、A2M、GHR、FAS与RT2Profiler PCR Array结果一致。3、本研究通过RT-PCR检测CRC患者组织,结果显示CXCL9、IL6ST、A2M、GHR、FAS与RT2Profiler PCR Array的结果一致。Western blot结果显示CRC组织中IL6ST表达显著下调,而CXCL9表达显著上调,与之前的结果一致。4、本研究对90例CRC和30例正常组织样本进行了H&E染色和免疫组化检测。结果显示:1)在CRC组织中,IL6ST表达量较正常组织低,且随着分化程度降低,IL6ST的高表达相对减少;2)在CRC组织中,CXCL9表达量较正常组织高;且随着分化程度降低,CXCL9的高表达相对增加;3)IL6ST和CXCL9的表达呈负相关关系。4)IL6ST和CXCL9与患者的生存情况相关。5、Western blot结果显示过表达IL6ST的HT29细胞中,STAT3的表达无明显差异;与对照组相比,p-STAT3的表达明显升高。6、细胞学结果显示1)过表达IL6ST使HT29细胞增殖能力增强,但细胞周期并无明显改变;2)过表达IL6ST的HT29细胞凋亡显著减少;3)过表达IL6ST可提高HT29细胞迁移和侵袭能力。4)过表达IL6ST的HT29细胞粘附率明显降低。结论:1、在CRC组织中,CXCL9表达上调,GHR,IL6ST,A2M和FAS表达下调,差异具有统计学意义。2、IL6ST和CXCL9的表达呈负相关关系,均与CRC的临床特征密切相关,高表达IL6ST患者预后差,而高表达CXCL9患者预后较好。3、在HT29细胞中,过表达IL6ST上调p-STAT3的表达。4、过表达IL6ST增强HT29细胞增殖、迁移、侵袭能力,降低粘附率,减少细胞凋亡。